第六章基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定

第六章基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定第1頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起單酶切、雙酶切第一節(jié)DNA的體外重組DNA的體外重組：將目的基因與載體連接，這種重新組合的DNA稱為重組DNA。第2頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（一）直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1~10%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’二、平末端（bluntend）的連接第3頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（1）同聚加尾法（二）人工加尾形成“粘性末端”DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。②加尾－堿基互補(bǔ)第4頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來操作繁瑣；外源片段難以回收；同聚物尾巴影響外源基因表達(dá)。非酶切位點(diǎn)第5頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（2）銜接物（linker）連接Linker：用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的，具有一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的平末端雙鏈寡核苷酸GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：（二）人工加尾形成“粘性末端”第6頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（1）多核苷酸激酶處理（2）T4連接酶連接（3）限制性內(nèi)切酶消化（4）目的片段與載體連接第7頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（二）人工加尾形成“粘性末端”（3）DNA接頭（adapter）連接法①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’第8頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一接頭與接頭以粘末端連接，影響與DNA片段的連接②優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。③缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。④防止自我連接5‘p-GATCCCGG-

GGCC-CCGGGGCCCTAG-p5’第9頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-3’

GGCC-p5’BamHIadapterP--P

5’HO-GATCCCGG-GGCC

CCGG-GGCCCTAG-OH5’5’HO-GATCCCGG3’GGCC-OH5’nick缺口nick缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接T4多核苷酸激酶處理使5’磷酸化第10頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計(jì)原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3’端15～20bp與模板互補(bǔ)；5’端內(nèi)切酶識別序列＋保護(hù)堿基避免與所擴(kuò)增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。第11頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’CCTAGGCGC

PCR產(chǎn)物-5’3’-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)AATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’CCTAG

PCR產(chǎn)物-5’3’-GGEcoRIBamHI兩頭各有一個粘性末端！第12頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA三、PCR產(chǎn)物的連接2.與T載體直接連接第13頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（一）轉(zhuǎn)化（transformation）大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（三）轉(zhuǎn)染（transfection）受體菌直接捕獲噬菌體DNA的過程。（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。第14頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化堿金屬離子介導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化PEG1000轉(zhuǎn)化法電擊法（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞（三）導(dǎo)入動物細(xì)胞第15頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一1.利用原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2

PEG插入外源基因的載體共轉(zhuǎn)化：將兩個以上的基因同時導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化細(xì)胞達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1%~2%，轉(zhuǎn)化率受再生率影響共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%~33%第16頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一

酵母0.1mol/LLiCl處理感受態(tài)2.堿金屬離子介導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化插入外源基因的載體40%PEG4000熱激涂布選擇性平板，篩選轉(zhuǎn)化子

吸收線性DNA能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍轉(zhuǎn)化率：103個

/g

DNA；共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極少第17頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一4.電擊轉(zhuǎn)化（1）適于原生質(zhì)體和完整細(xì)胞（2）轉(zhuǎn)化率高，105個/gDNA（3）單鏈轉(zhuǎn)化率高于雙鏈單鏈含有酵母復(fù)制子可轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制，無復(fù)制子可同源整合到受體菌染色體上缺點(diǎn)：需要特定儀器，成本較高3.PEG1000轉(zhuǎn)化PEG處理酵母細(xì)胞，可獲得類感受態(tài)，用于轉(zhuǎn)化第18頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（農(nóng)桿菌介導(dǎo)）DNA直接導(dǎo)入（基因搶法、電擊法等）種質(zhì)系統(tǒng)法（花粉管通道法等）（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞（三）導(dǎo)入動物細(xì)胞第19頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將目的基因插入到載體的T-DNA區(qū)，形成重組DNA將重組DNA轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌通過農(nóng)桿菌侵染植物外植體將含有外源目的基因的T-DNA整合到植物細(xì)胞基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因植株第20頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一在飼養(yǎng)平皿的濾紙上培養(yǎng)2天葉盤法的具體操作第21頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一又稱生物彈擊法、微彈轟擊法，借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細(xì)胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)。DNA1.2m鎢彈頭吸附金屬微粒加速，進(jìn)入受體細(xì)胞基因槍裝入