第十三單元綜合性實(shí)驗(yàn)演示文稿

第十三單元綜合性實(shí)驗(yàn)演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有35頁\編輯于星期一優(yōu)選第十三單元綜合性實(shí)驗(yàn)現(xiàn)在是2頁\一共有35頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)原理

檢測(cè)傷寒O抗體在傷寒菌感染的診斷中具有重要意義，采用肥達(dá)反應(yīng)可對(duì)抗體進(jìn)行半定量檢測(cè)；若采用新一代的免疫檢測(cè)技術(shù)建立對(duì)傷寒O抗體準(zhǔn)確定量檢測(cè)的法，則可提高臨床診斷效果。以傷寒O抗原免疫動(dòng)物，制備出抗傷寒O的抗體，將后者純化抗體與酶連接制備成酶標(biāo)抗體;以傷寒O抗原包被酶標(biāo)板，制備傷寒酶標(biāo)抗體為競(jìng)爭(zhēng)抗體，以競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)傷寒抗體酶聯(lián)免疫檢技術(shù)?，F(xiàn)在是3頁\一共有35頁\編輯于星期一1.傷寒沙門菌菌體“O”抗原（免疫用）2.傷寒沙門菌可溶性菌體“O”抗原（包備用）3.飽和硫酸銨溶液4.酶標(biāo)用洗滌液5.酶標(biāo)用稀釋液6.酶標(biāo)用底物液7.酶標(biāo)用終止液(2mol/LH2SO4)8.傷寒“O”抗原包被酶標(biāo)板9.待檢血清標(biāo)本10.實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)陽性血清11.ELISA讀數(shù)儀實(shí)驗(yàn)材料

現(xiàn)在是4頁\一共有35頁\編輯于星期一制備抗傷寒O抗體和O抗原抗體純化酶(HRP)標(biāo)記抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)傷寒O抗體條件的優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)曲線確定標(biāo)本檢測(cè)與結(jié)果判斷實(shí)驗(yàn)流程

現(xiàn)在是5頁\一共有35頁\編輯于星期一取傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（傷寒沙門菌O901）的典型光滑型菌落，密集劃線接種于普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，用無菌生理鹽水洗下菌苔，移入無菌的三角燒瓶中。充分振搖，置100℃水浴1h，殺菌及破壞H抗原。菌懸液離心，4000r/min，10min，棄上清。菌體再用無菌生理鹽水洗滌，棄上清。無活菌試驗(yàn)合格后，用無菌生理鹽水稀釋成8~10億／ml，即成傷寒沙門菌“O”菌體抗原。實(shí)驗(yàn)方法

傷寒沙門菌菌體“O”抗原（免疫用）

現(xiàn)在是6頁\一共有35頁\編輯于星期一取傷寒沙門菌O901接種于普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，用無菌生理鹽水洗下菌苔，配成70~100億/ml菌懸液，隔水煮沸2h，離心，3500r/min，10min，取上清即傷寒沙門菌可溶性菌體“O”抗原。傷寒沙門菌可溶性菌體“O”抗原（包備用）日期第1天第2天第3天第4天第5天抗原劑量（ml）0.10.20.30.51.0途徑多點(diǎn)皮內(nèi)耳緣靜脈耳緣靜脈耳緣靜脈耳緣靜脈表1制備細(xì)菌免疫血清的免疫程序現(xiàn)在是7頁\一共有35頁\編輯于星期一抗體制備

制備抗傷寒O抗體推薦快速免疫方案供參考采用（表1）：取已制備的傷寒沙門氏菌體O抗原（１０億／ml），免疫程序如下表。最后兩次注射劑量較大，要緩慢推注。在末次免疫2天后試血，采用直接凝集法測(cè)定效價(jià)（見第二單元）。如凝集效價(jià)大于1∶1280，則可于一周后放血。效價(jià)過低，可再加強(qiáng)注射。日期第1天第2天第3天第4天第5天抗原劑量（ml）0.10.20.30.51.0途徑多點(diǎn)皮內(nèi)耳緣靜脈耳緣靜脈耳緣靜脈耳緣靜脈表1制備細(xì)菌免疫血清的免疫程序現(xiàn)在是8頁\一共有35頁\編輯于星期一

1份免疫血清加1份生理鹽水，邊攪拌邊滴加2份飽和硫酸銨溶液，于4℃靜置2h，2000r/min離心20min，吸棄上清，將沉淀溶于適量生理鹽水（盡量保持高蛋白濃度），放置透析袋中，多次更換生理鹽水(透析液)，得初步純化的免疫抗體。采用改良NaIO4標(biāo)記法將酶與抗體的連接，其他備選的標(biāo)記方法請(qǐng)參考單元一?？贵w的純化與酶標(biāo)記

現(xiàn)在是9頁\一共有35頁\編輯于星期一取5mgHRP溶于0.5ml雙餾水中，加入新配制的0.06MNaIO4水溶液0.5ml，混勻，4℃30min；再加入0.16M乙二醇水溶液（10mlH2O+0.09ml乙二醇）0.5ml，室溫放置30min。然后加入含5mg純化抗體的水溶液1ml，混勻，并裝入透析袋，于0.05MpH9.5碳酸鹽緩沖液中攪拌透析6h（或過夜），使之結(jié)合；加入NaBH4溶液（5mg/ml）0.2ml，混勻，4℃2h；最后緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，4℃30min，離心，去上清，以0.02MpH7.4PBS液溶解沉淀并4℃透析除鹽過夜；次日取出離心，去除沉淀，即得酶-抗體（HRP-IgG）結(jié)合物，以0.02MpH7.4PBS液加至5ml。改良NaIO4標(biāo)記法將酶現(xiàn)在是10頁\一共有35頁\編輯于星期一①將酶標(biāo)抗體用稀釋液做系列稀釋，加入包被有傷寒抗原的酶標(biāo)板中（50μl/孔），37℃30min。②洗滌液充分洗滌3次，甩干。③各孔內(nèi)加底物液0.1ml，置暗處20min。④各孔內(nèi)加入終止液終止反應(yīng)。⑤用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。以O(shè)D值在0.８左右的最小稀釋倍數(shù)為待檢樣本的最佳稀釋倍數(shù)?？垢?jìng)爭(zhēng)法酶標(biāo)抗體工作濃度的確定現(xiàn)在是11頁\一共有35頁\編輯于星期一①從5倍開始用酶標(biāo)稀釋液進(jìn)行系列倍比稀釋（連續(xù)稀釋10個(gè)管），與確定工作濃度的酶標(biāo)抗體一同加入包被有傷寒抗原的酶標(biāo)板中，另在2孔中加入稀釋液作空白對(duì)照，置37℃恒溫箱30min。②取出用洗滌液充分洗滌3次，甩干。③各孔內(nèi)加底物液0.1ml，置暗處20min。④各孔內(nèi)加入終止液終止反應(yīng)。⑤用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值?？瞻讓?duì)照OD值在0.8左右實(shí)驗(yàn)成立，以標(biāo)本OD值在0.8～0.05的稀釋度（抗體單位）作為標(biāo)準(zhǔn)品的工作范圍，根據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗體血清所測(cè)得的OD值，在方格紙上以O(shè)D值為x軸，抗體單位為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

現(xiàn)在是12頁\一共有35頁\編輯于星期一按預(yù)試驗(yàn)摸索的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定：①將標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行系列倍比稀釋（連續(xù)稀釋10個(gè)管）。②將待檢血清用酶標(biāo)稀釋液適當(dāng)稀釋。③稀釋液作空白對(duì)照。④將稀釋的酶標(biāo)抗體（50μl/孔），同待檢標(biāo)本、不同單位的標(biāo)準(zhǔn)血清和空白對(duì)照標(biāo)本一同加入包被有傷寒抗原的酶標(biāo)板中（50μl/孔）。⑤置37℃恒溫箱30min。⑥加底物，終止反應(yīng)后檢測(cè)OD值。標(biāo)本檢測(cè)現(xiàn)在是13頁\一共有35頁\編輯于星期一

陽性標(biāo)本反應(yīng)孔不顯色，空白標(biāo)本反應(yīng)孔顯色說明實(shí)驗(yàn)成立。根據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗體血清所測(cè)得的OD值和其所對(duì)應(yīng)的抗體單位標(biāo)繪制準(zhǔn)曲線或建立的回歸方程，根據(jù)繪制的準(zhǔn)曲線求出每個(gè)標(biāo)本的抗體單位。結(jié)果判定

現(xiàn)在是14頁\一共有35頁\編輯于星期一

1.請(qǐng)就方法學(xué)評(píng)價(jià)肥達(dá)反應(yīng)和競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)傷寒“O抗體”。例如，方法的穩(wěn)定性、特異性和敏感性。

2.人類與傷寒沙門菌接觸密切，通常情況下傷寒抗體均陽性。個(gè)體傷寒O抗體水平與傷寒感染和機(jī)體免疫狀態(tài)有關(guān)，因此建立群體傷寒O抗體水平的正常范圍對(duì)判定個(gè)體傷寒的感染和機(jī)體免疫狀態(tài)具有重要價(jià)值。如何建立新方法檢測(cè)傷寒O抗體的參考范圍（正常值）?實(shí)驗(yàn)討論

吉林醫(yī)藥學(xué)院李妍現(xiàn)在是15頁\一共有35頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)二機(jī)體免疫功能評(píng)估

（綜合性實(shí)驗(yàn)）現(xiàn)在是16頁\一共有35頁\編輯于星期一無胸腺的裸鼠是T細(xì)胞選擇性缺陷的天然動(dòng)物模型現(xiàn)在是17頁\一共有35頁\編輯于星期一人的重癥聯(lián)合型免疫缺陷綜合征現(xiàn)在是18頁\一共有35頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)原理

利用淋巴細(xì)胞敏感的細(xì)胞毒藥物抑制或殺傷淋巴細(xì)胞，使機(jī)體免疫功能低下。給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（小鼠）注射抗原，通過觀察小鼠機(jī)體免疫抗體的反應(yīng)水平評(píng)價(jià)機(jī)體的體液免疫水平。二硝基氟苯（DNFB）是一種半抗原，將其溶液涂抹腹壁皮膚后，與皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞。4～7天后將其再次涂抹，可使局部產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)（水腫），通過觀察遲發(fā)型超敏反應(yīng)程度對(duì)小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫功能做出評(píng)價(jià)。.雞卵卵核蛋白抗原是天然的可溶性抗原，注入機(jī)體可誘導(dǎo)特異抗體產(chǎn)生，當(dāng)免疫細(xì)胞受到抑制，B細(xì)胞活化和抗體產(chǎn)生能力下降，檢測(cè)特異性抗體產(chǎn)生可評(píng)價(jià)體液免疫功能?，F(xiàn)在是19頁\一共有35頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)材料

1.免疫抑制劑環(huán)磷酰胺，氫化可的松。2.免疫抗原1%的二硝基氟苯（DNEB），雞卵卵核蛋白。3.酶標(biāo)用洗滌液，稀釋液，底物液，酶標(biāo)用終止液（2mol/LH2SO4）。4.抗原包被的酶標(biāo)板用包被液將免疫用抗原稀釋20倍加到酶標(biāo)板中，每孔0.1ml，置濕盒中4℃過夜；次日取出，用蒸餾水充分洗滌3次，甩干備用。5.酶標(biāo)儀6.酶標(biāo)抗小鼠IgG抗體。7.抗體標(biāo)準(zhǔn)品多支小鼠抗雞卵卵核蛋白抗體的混合物。8.1ml注射器，采血用手術(shù)器械，分離血清用器材，天平，繪圖紙等?，F(xiàn)在是20頁\一共有35頁\編輯于星期一基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組抗原激發(fā)造模組遲發(fā)型超敏反應(yīng)（二硝基氟苯）特異性抗體的誘發(fā)（雞卵卵核蛋白）抗體效價(jià)測(cè)定皮膚超敏反應(yīng)觀察空白組實(shí)驗(yàn)流程

非免疫動(dòng)物現(xiàn)在是21頁\一共有35頁\編輯于星期一1.二硝基氟苯致敏:將小鼠腹部去毛，范圍約3×3cm2大小，并將１％DNFB溶液均勻涂抹于上。2.可溶抗原致敏:取小鼠于大腿內(nèi)側(cè)注射卵核抗原0.2ml/只?？乖?。

實(shí)驗(yàn)方法

基礎(chǔ)免疫

現(xiàn)在是22頁\一共有35頁\編輯于星期一將做過基礎(chǔ)免疫的小鼠隨機(jī)分成兩組（造模組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組）；另取數(shù)量相等的未經(jīng)免疫的小鼠為空白對(duì)照組。造模組小鼠可采用以下方法之一誘導(dǎo)免疫抑制,也2方法均用,進(jìn)行對(duì)比。方法一:每鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg（參考劑量），連續(xù)5天后免疫功能顯著降低。方法二：每鼠每天腹腔注射氫化可的松50mg/kg（參考劑量），5天后免疫功能顯著受抑。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與免疫模型建立

現(xiàn)在是23頁\一共有35頁\編輯于星期一致敏后第7天，將１％DNFB溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進(jìn)行攻擊，空白對(duì)照組同樣涂耳但未致敏。攻擊后24h，剪下左右耳殼，取同樣大小的耳片，稱重。遲發(fā)型超敏反應(yīng)激發(fā)(細(xì)胞免疫功能檢測(cè))

特異性抗體的誘發(fā)(體液免疫功能檢測(cè))

基礎(chǔ)免疫后第7天再次注射抗原，方法同基礎(chǔ)免疫。5-7天后采血測(cè)抗體。在優(yōu)化間接法檢測(cè)小鼠抗卵核抗原的條件的基礎(chǔ)上;采ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和空白組小鼠特異抗體的濃度。現(xiàn)在是24頁\一共有35頁\編輯于星期一優(yōu)化間接法檢測(cè)小鼠抗卵核抗原的條件①將待檢血清從5倍開始用酶標(biāo)稀釋液進(jìn)行系列倍比稀釋（連續(xù)稀釋10個(gè)管），分別加入已用抗原包被好的酶標(biāo)板中（每孔加0.1ml），置37℃恒溫箱30min。②取出用洗滌液充分洗滌3次，甩干。③各孔加酶標(biāo)抗體0.1ml，置37℃恒溫箱30min。④取出用洗滌液充分洗滌3次，甩干。⑤各孔內(nèi)加底物液0.1ml，置暗處20min。⑥各孔內(nèi)加入終止液終止反應(yīng)。⑦用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。以O(shè)D值在0.30左右的最小稀釋倍數(shù)為待檢樣本最佳稀釋倍數(shù)?，F(xiàn)在是25頁\一共有35頁\編輯于星期一①將待檢血清按預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的稀釋倍數(shù)用酶標(biāo)稀釋液進(jìn)行稀釋，分別加入已用抗原包被好的酶標(biāo)板中（每孔加0.1ml）。②將標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行系列倍比稀釋（連續(xù)稀釋10個(gè)管），分別加入已用抗原包被好的酶標(biāo)板中（每孔加0.1ml）。③另在2孔中加入稀釋液作空白對(duì)照。④置37℃恒溫箱30min。⑤洗滌，加酶標(biāo)抗體，加底物，終止反應(yīng)和檢測(cè)OD值。優(yōu)化間接法檢測(cè)小鼠抗卵核抗體現(xiàn)在是26頁\一共有35頁\編輯于星期一1.細(xì)胞免疫功能的判定以剪下的左右耳片重量之差為遲發(fā)型超敏反應(yīng)程度，可以反映機(jī)體細(xì)胞免疫水平。模型組免疫功能下降，遲發(fā)型超敏反應(yīng)強(qiáng)度下降。結(jié)果判斷

現(xiàn)在是27頁\一共有35頁\編輯于星期一2.體液免疫根據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗體血清所測(cè)得的OD值（標(biāo)準(zhǔn)血清及待檢血清OD值在計(jì)算時(shí)均應(yīng)減去空白對(duì)照OD值），在方格紙上以O(shè)D值為x軸，抗體單位為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；或采用數(shù)學(xué)模型進(jìn)行線性轉(zhuǎn)化，建立回歸方程。根據(jù)標(biāo)繪制的準(zhǔn)曲線或建立的回歸方程，可以求出每個(gè)標(biāo)本的抗體單位。模型組免疫功能下降，特異抗體產(chǎn)生下降?，F(xiàn)在是28頁\一共有35頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)討論

1.舉例說明人體在哪些情況下發(fā)生免疫缺陷。

2.針對(duì)本實(shí)驗(yàn)建立的模型，你還能想到哪些方法或指標(biāo)來評(píng)價(jià)免疫功能？現(xiàn)在是29頁\一共有35頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)三免疫相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)診斷

（科研設(shè)計(jì)）現(xiàn)在是30頁\一共有35頁\編輯于星期一免疫學(xué)檢驗(yàn)的與臨床疾病對(duì)自身免疫性疾病的診斷對(duì)免疫增生性疾病的診斷對(duì)感染性疾病的診斷對(duì)機(jī)體免疫狀態(tài)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)腫瘤標(biāo)志物對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷或病情監(jiān)測(cè)現(xiàn)在是31頁\一共有35頁\編輯于星期一主要課程討論安排

第一階段:重點(diǎn)是與臨床醫(yī)師和患者本人接觸，或通過查閱有關(guān)書籍和互聯(lián)網(wǎng)增加對(duì)疾病和疾病的診斷過程的感性認(rèn)識(shí);第二階段:有針對(duì)性地、系統(tǒng)地收集有關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)診斷數(shù)據(jù)和資料，作為分析和討論的基礎(chǔ)；第三階段:對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和資料進(jìn)行總結(jié)分析并提出有關(guān)設(shè)想或新的實(shí)驗(yàn)診斷方案；第四階段:回到臨床與臨床醫(yī)師或指導(dǎo)教師共同探討有關(guān)診斷的做出方案的合理性并形成文字材料，召開有專家參加的討論會(huì)或報(bào)告會(huì)?，F(xiàn)在是32頁\一共有35頁\編輯于星期一免疫學(xué)診斷的核心內(nèi)容是