紙層析法分離氨基酸

紙層析法分別氨基酸姓名：敖禮賢學號：5602212022班級：生物工程121一、前百1、爭論意義與前景層析法是采用混合物中各組分物理化學性質(zhì)的差異（如吸附力、分子外形及大小、分子親和力、安排系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流淌相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分別的目的。[1]紙層析法（paperchromatography）是生物化學上分別、鑒定氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定；也是定性或定量測定多肽、核酸堿基、糖、有機酸、維生素、抗菌素等物質(zhì)的一種分別分析工具。紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的安排層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機溶溶劑是流淌相?！?】安排層析法安排色譜系色譜法之一種，采用固定相與流淌相之間對待分別組分溶解度的差異來實現(xiàn)分別。安排色譜的固定相一般為液相的溶劑，依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱或者擔體表面。安排色譜過程本質(zhì)上是組分分子在固定相和流淌相之間不斷達到溶解平衡的過程?！?】2、試驗目的（1）把握安排層析的原理，學習氨基酸紙層析法的操作技術(shù)（包括點樣、平衡、展層、顯色、鑒定及定量）（2）學習未知樣品的氨基酸成分（水解、層析及鑒定）分析的方法。3、試驗原理層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學家MichaelTswett發(fā)覺并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流淌后形成不同的色帶而被分開,由此得名為“色譜法”（Chromatography）。后來無色物質(zhì)也可采用吸附柱層析分別。1944年消失紙層析。以后層析法不斷進展，相繼消失氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析法是采用混合物中各組分物理化學性質(zhì)的差異（如吸附力、分子外形及大小、分子親和力、安排系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流淌相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分別的目的。按層析過程的機理分類：吸附層析：采用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分別鑒定的目的。安排層析：采用不同組分在流淌相和固定相之間的安排系數(shù)不同，使之分別。離子交換層析：采用不同組分對離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：采用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的安排層析法，它是采用不同的氨基酸在展層溶劑中的安排系數(shù)不同而得以分別的一種方法。惰性支持物是新華一號濾紙，其上含有許多的羥基，與水有較強的親和力因此把它看成是含有靜止水相的惰性支持物。水相因此稱為靜止相（固定相），有機溶劑稱為流淌相。展層溶劑由兩個互不相溶的有機溶劑和水組成，它們相互混合時便分成兩相：一相是以水飽和了的有機相，另一相是以有機溶劑飽和了的水相。安排系數(shù)（a）=溶質(zhì)在固定相的濃度（CS）/溶質(zhì)在流淌相的濃度（CL）當用濾紙進行安排層析時，流淌相流經(jīng)支持物時與固定相之間連續(xù)抽提，使氨基酸在兩相之間不斷安排而得以分別。安排層析的原理可用一個模式解釋（英國Martin等）：把濾紙看成是一個層析柱，可以分成若干層板，設層板的物質(zhì)為A、B；且A和B的安排系數(shù)（a）分別為1和1/3；又設固定相為S,流淌相為L,兩相相互接觸但不相混溶。當?shù)谝粚恿魈氏嘀屑尤肟隙康腁、B兩項物質(zhì)后，溶質(zhì)依據(jù)各自的安排系數(shù)在第一層的兩相中安排，流淌相連續(xù)在流淌，此時第一層固定相與新流到的流淌相之間以及原來第一層流淌相與其次層固定相之間進行其次次安排，以此類推三次安排即可看出A與B最濃部分以分開，A在其次層最濃，B在第三層最濃，假如連續(xù)抽提下去，經(jīng)過若干此后，A、兩物質(zhì)便可完全分開。明顯，安排系數(shù)越大的,則越易分開。物質(zhì)被分別后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值（比移值）來表示的：1^=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離在肯定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)；層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本試驗采用紙層析法分別氨基酸。無色物質(zhì)的層析圖譜可用光譜法或顯色法鑒定。本試驗采納荀三酮為顯色劑。荀三酮顯色反應受溫度、ph、時間影響較大。假如要使結(jié)果重復，必需嚴格掌握上述條件。二、試驗材料與方法1、試驗試劑.氨基酸標準液（lmg/ml）四種氨基酸是甘氨酸、亮氨酸、肺氨酸、混合氨酸分別配置成肯定濃度的溶液.80%甲酸.0.5%前三酮溶液.氨基酸混合液.正丁醇2、試驗器材.新華濾紙.培育皿.電熱鼓風干燥箱.點樣管及點樣架.針、線、尺.燒杯.鐘罩3、試驗操作（一）標準氨基酸紙上層析1、單向上行層析（1）氨基酸Rf值的測定A、濾紙：選用國產(chǎn)新華1號濾紙，28cmX28cm,在距紙邊2cm處，用鉛筆輕輕劃一條線，于線上每隔3cm處畫一小圓圈作為點樣處，圈直徑不超過O.ScmoB、點樣：點樣要合適，樣品點的太濃，斑點易集中或拉長，以致分別不清，氨基酸的點

樣量以每種氨基酸含5-20ug為宜，將預備好的濾紙懸掛在點樣架上，濾紙垂直桌面，用點樣管吸取氨基酸樣品10ug,在濾紙垂直方向輕輕碰觸點樣中心，這時樣品就自動流出。點樣的集中直徑掌握在0.5cm之內(nèi)，點樣過程中必需在第一滴樣品干后再點其次滴。C、將點好的樣品的濾紙倆側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。留意縫線處的紙的倆邊不要接觸，避開由于毛細管現(xiàn)象使溶劑沿倆邊移動特殊快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值。D、酸溶劑系統(tǒng)：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2,前三酮2mL溫度25*C,時間訃。留意：使用的溶劑系統(tǒng)需新奇配制，并要搖勻。展層溶劑每張約需25ml。E、顯色：待展層基本結(jié)束后，置65.C鼓風箱中10—20min,鼓風保溫，濾紙上即顯出紫紅色\黃色斑點。F、Rf值的計算：用尺測量顯色斑點的中點與原點之間的距離和原點到溶劑前沿的距離，求出此值，即得氨基酸的Rf值，計算出4種氨基酸在酸系統(tǒng)中的Rf值。三、試驗數(shù)據(jù)與分析甘氨酸甘氨酸甘氨酸亮氨酸脯氨霰混合氨酸原點到層析點甘氨酸亮氨酸脯氨霰混合氨酸原點到層析點14中點的距離(mm)原點到層析點14中點的距離原點到層析點14中點的距離(mm)6036原點到溶劑前70原點到溶劑前70原點到溶劑前707070沿的距離(mm)RfRfRf0.2000.8570.514Rf0.2000.8570.514四、爭論1、留意事項.點樣時要避開手指或唾液等污染濾紙有效面(即展層時樣品可能達到的部分)。.點樣斑點不能太大，防止層析后氨基酸斑點過度集中和重疊，且點樣后吹風溫度不宜過高，以免樣品變性(斑點發(fā)黃)。.展層開頭時切勿使樣品點浸入溶劑中。(4),展層劑要臨用前配制，以免發(fā)生酯化，影響層析結(jié)果。2、思索題(1)、紙層析法分別氨基酸為什么在展層時使用一種溶劑系統(tǒng)，有時使用倆種溶劑系統(tǒng)？這是依據(jù)Nernst在1891年提出的安排定律：一種溶質(zhì)在兩種給定的互不相溶的溶劑中安排時，在肯定溫度下達到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比為一常數(shù)，即安排系數(shù)(Kd)。Kd=Ca/CbCa和Cb是互不相溶的兩相，即A相和B相的濃度。這里的兩相可以使固相、液相和氣相。意思就是溶質(zhì)在A和B兩種溶劑組成的混合溶劑里安排時，安排比是恒定的。(2)、酸性溶劑系統(tǒng)對氨基酸極性基團的解離有何影響？酸性溶液中，