PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)方法及原理-2023修改整理

千里之行，始于足下讓知識(shí)帶有溫度。第2頁/共2頁精品文檔推薦PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)方法及原理PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)辦法及原理

（一）設(shè)計(jì)引物前應(yīng)的預(yù)備工作：

1．預(yù)備載體圖譜，大致預(yù)備把片斷插在那個(gè)部分

2．對(duì)片斷舉行酶切分析，確定一下那些酶切位點(diǎn)不能用

3．預(yù)備一本所買公司的酶的商品名目，便于查酶的各種數(shù)據(jù)及兩種酶是否可以配用

（二）引物的結(jié)構(gòu)：5’—庇護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+引物配對(duì)區(qū)—3’

1．兩個(gè)酶切位點(diǎn)

2．酶切位點(diǎn)的庇護(hù)堿基

3．5’端庇護(hù)堿基

4．3’端庇護(hù)堿基

5．引物配對(duì)區(qū)

（三）設(shè)計(jì)引物所要考慮的問題

1．酶切位點(diǎn)

兩個(gè)酶切位點(diǎn)應(yīng)是載體上的，所銜接片斷上沒有這兩個(gè)位點(diǎn)，且距離不能太近，否則往往導(dǎo)致兩個(gè)酶都切不好。因此，兩個(gè)酶切位點(diǎn)要緊挨在一起，只能切一個(gè)，除非恰好是與上面兩個(gè)酶在一起的酶切位點(diǎn)，最好隔四個(gè)核苷酸。且不能有堿基的交錯(cuò)，比如AGATCTTAAG，這樣的位點(diǎn)比較難切。

2．酶的挑選

最好使用雙酶切效率高的，但兩個(gè)酶切點(diǎn)最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補(bǔ)），否則效果相當(dāng)于單酶切，最好使用具有共同buffer，且較常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），這樣可以省錢。

3．Tm的計(jì)算。

Tm是由互補(bǔ)的DNA區(qū)域打算的，而不互補(bǔ)的區(qū)域?qū)NA的溶解是沒有作用的。因此，對(duì)于引物的Tm，惟獨(dú)和模板互補(bǔ)的區(qū)域?qū)m才有貢獻(xiàn)。計(jì)算Tm時(shí)，

只計(jì)算互補(bǔ)的區(qū)域（除非你的酶切位點(diǎn)也與模板互補(bǔ)）。設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，先不管5'端的修飾序列，把互補(bǔ)區(qū)的Tm控制在55度以上（我喜愛?控制在58以上，詳細(xì)按照PCR的詳細(xì)狀況，對(duì)于困難的PCR，需要適當(dāng)提高Tm），再加上酶切位點(diǎn)和庇護(hù)堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。

Tm溫度高的引物就比較簡(jiǎn)單克服3’發(fā)卡、二聚體及3'非特異結(jié)合等問題。容易的計(jì)算公式可以用2+4的公式。若你計(jì)算的Tm值達(dá)到了快90，不包括酶切位點(diǎn)。引物公司給你發(fā)的單子是包括酶切位點(diǎn)的。自己可以再估量一下。如你設(shè)計(jì)了帶酶切位點(diǎn)的引物，總長(zhǎng)分離為29、33個(gè)堿基，去掉酶切位點(diǎn)和庇護(hù)堿基，分離為17、21個(gè)堿基。引物公司給的單子是70多度，實(shí)際用的惟獨(dú)50度，用55度擴(kuò)的結(jié)果也差不多。

其它關(guān)于Tm值的計(jì)算，實(shí)用PP5.0舉行評(píng)價(jià)的，需要考慮basenumber、GC%、Tm、hairpin、dimer、falsepriming、crossdimer等參數(shù)。

4．退火溫度

退普通退火溫度為Tm-5度，退火溫度的計(jì)算可以不把加入的酶切位點(diǎn)及庇護(hù)堿基考慮進(jìn)去，PCR幾個(gè)循環(huán)后，引物外側(cè)的序列已經(jīng)參入了擴(kuò)增片斷中，所以你可以在預(yù)變性后多加幾步，溫度比你Tm值低些（這樣可能會(huì)增強(qiáng)非特異性），Tm值是你包括酶切位點(diǎn)及庇護(hù)堿基的Primer計(jì)算出來的。

5．5’端庇護(hù)堿基

普通在5'端加庇護(hù)堿基,假如你擴(kuò)增后把目的條帶做膠回收轉(zhuǎn)入T-VECTOR或者其它的載體的話,酶切時(shí)可以不需加庇護(hù)堿基

6．引物二聚體

關(guān)于引物二聚體，最好用primer或是其他設(shè)計(jì)引物的軟件舉行計(jì)算一下，看看引物之間的△G（自由能）的肯定值，假如小于10，普通是問題的。假如稍大，PCR時(shí)可以提高一下退火溫度，普通是沒有問題的。假如3’端形成二聚體，并且自由能肯定值較大，假如PCR沒有條帶，建議重新設(shè)計(jì)引物。此外，所加的三個(gè)核苷酸的庇護(hù)序列經(jīng)過盡心設(shè)計(jì)有時(shí)也可以降低二聚體的△G。

7．引物的設(shè)計(jì)

在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是由于，一個(gè)特異性引物普通都是20bp左右，再加上酶切位點(diǎn)序列和庇護(hù)性堿基，大致就是28bp左右了。而我們?cè)谠O(shè)計(jì)退火溫度時(shí)，與引物的長(zhǎng)度有關(guān)，比正常的引物(20bp)的

Tm絕對(duì)要高一些。假如我們能利用引物自身的部分序列，就可以有效地削減引物的長(zhǎng)度。

還有，有些酶是離不開末端序列的，因此，在設(shè)計(jì)一個(gè)酶位點(diǎn)時(shí)，最好把該酶的性質(zhì)弄清晰。設(shè)計(jì)時(shí)限制性酶切位點(diǎn)是應(yīng)當(dāng)在5’端的頂端。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，常在5’端添加酶切位點(diǎn)，以利于PCR產(chǎn)物銜接到載體。

設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。先用軟件設(shè)計(jì)出合適的引物，引物的3’端是引發(fā)延長(zhǎng)的起點(diǎn)，因此一定要與模板精確?????配對(duì)，應(yīng)盡量避開在引