第十章基因重組要

第十章基因重組要第1頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)

DNA的重組

DNARecombination

第2頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

(transduction)轉(zhuǎn)座

(transposition)同源重組

(homologousrecombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specificrecombination)第3頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二發(fā)生在同源序列間的重組稱(chēng)為同源重組(homologousrecombination)，又稱(chēng)基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過(guò)鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。一、同源重組第4頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Holliday模型中，同源重組主要4個(gè)關(guān)鍵步驟①兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊②一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體③通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)第5頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二片段重組體

：切開(kāi)的鏈與原來(lái)斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同一親本DNA。拼接重組體：切開(kāi)的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本DNA。

5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′第6頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄第7頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體目錄第8頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱(chēng)為接合作用(conjugation)。第9頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)

質(zhì)粒——細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子第10頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）轉(zhuǎn)化作用通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱(chēng)為轉(zhuǎn)化作用

(transformation)。

第11頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。第12頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二目錄第13頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。第14頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑(lysispathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenicpathway)例目錄第15頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第16頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三、位點(diǎn)特異重組位點(diǎn)特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。例（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)。

第17頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二例（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變

第18頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。第19頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門(mén)氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變第20頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二例（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLVDJC第21頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號(hào)序列基因片段第22頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開(kāi)RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)單鏈切開(kāi)轉(zhuǎn)移核苷酸修復(fù)、連接免疫球蛋白基因重排過(guò)程目錄第23頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱(chēng)為轉(zhuǎn)座(transposition)。第24頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二插入序列(insertionsequences,IS)組成：二個(gè)分離的反向重復(fù)(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復(fù)序列一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因

IRTransposaseGeneIR發(fā)生形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)（一）插入序列轉(zhuǎn)座第25頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座目錄復(fù)制第26頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。

轉(zhuǎn)座子組成：反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座第27頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第28頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座目錄第29頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique第30頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年

G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977年美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專(zhuān)門(mén)應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開(kāi)始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉第31頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二相關(guān)概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系本節(jié)主要內(nèi)容第32頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone)來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱(chēng)為克隆化(cloning)，即無(wú)性繁殖。（一）DNA克隆第33頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）第34頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱(chēng)基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

第35頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱(chēng)基因工程，又稱(chēng)重組DNA工藝學(xué)。第36頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶第37頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無(wú)53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第38頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第39頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類(lèi)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）第40頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第41頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Ⅱ類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第42頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第43頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二同功異源酶來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱(chēng)同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ第44頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二同尾酶有些限制性?xún)?nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱(chēng)為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱(chēng)為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA第45頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)第46頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA第47頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱(chēng)為表達(dá)載體。第48頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱(chēng)為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。第49頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1.質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)

能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。第50頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二目錄第51頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第52頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列第53頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3.粘性質(zhì)粒(cosmid)第54頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他第55頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

第56頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過(guò)程目錄第57頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

（見(jiàn)第22章）第58頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列第59頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性?xún)?nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因目錄第60頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫(kù)目錄第61頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二mRNAcDNA雙鏈cDNA

重組DNA分子cDNA文庫(kù)

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*從cDNA文庫(kù)獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄第62頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建第63頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目錄第64頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目錄第65頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.平端連接適用于：限制性?xún)?nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端第66頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二目的基因載體限制性?xún)?nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄第67頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。第68頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄第69頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

第70頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄第71頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌第72頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡

2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等第73頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目錄第74頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二組氨酸缺陷型大腸桿菌無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救目錄第75頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二α互補(bǔ)目錄第76頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二α互補(bǔ)的檢測(cè)目錄第77頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二原位雜交目錄第78頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二Southern印跡目錄第79頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄第80頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體

第81頁(yè)，共92頁(yè)，2023年，2月20日，星期二重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開(kāi)環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄第82頁(yè)，