細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

———細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

細(xì)胞復(fù)蘇是與細(xì)胞凍存的過(guò)程相反，是指將凍存在液氮或者-80℃冰箱中的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng)，使細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)。當(dāng)恢復(fù)到常溫狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生化反應(yīng)恢復(fù)正常水平。與細(xì)胞凍存不同，細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程升溫要快，防止在解凍過(guò)程中水分進(jìn)入細(xì)胞，形成冰晶，影響細(xì)胞存活率。

實(shí)驗(yàn)材料

基礎(chǔ)培養(yǎng)基

血清（常規(guī)為FBS/NBS）

電動(dòng)移液槍

移液槍

移液管[NEST]

無(wú)冰冰盒[NEST]

T25培養(yǎng)瓶[NEST]

自動(dòng)旋蓋機(jī)[NEST]

盒裝無(wú)菌吸頭[NEST]

100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿[NEST]

15mL、50mL無(wú)菌離心管[NEST]

01不能忘記的準(zhǔn)備

1.記得一定要預(yù)定干冰?。。〔蝗荒慵?xì)胞取出來(lái)可沒(méi)地方待了，要是液氮罐距離實(shí)驗(yàn)室遠(yuǎn)點(diǎn)，你的細(xì)胞可能就沒(méi)了。

2.用來(lái)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的無(wú)冰冰盒一定要滅菌！?。‘?dāng)然，如果條件刻苦點(diǎn)的泡沫盒，也不要偷懶，無(wú)論什么裝載容器，都要提前滅菌，可以有效規(guī)避污染風(fēng)險(xiǎn)。

3.水浴鍋提前預(yù)熱至37℃。

4.培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃。

02要開(kāi)始了！（敲黑板）

1.在生物樣本庫(kù)中搜尋到目標(biāo)細(xì)胞,在液氮罐找到對(duì)應(yīng)的細(xì)胞，放入預(yù)先準(zhǔn)備好的無(wú)冰冰盒（容器）內(nèi)。冰盒內(nèi)裝有碎干冰，冰芯的鋁合金外殼協(xié)同高導(dǎo)熱的合金模塊，確保樣品能快速冷卻，孔之間的溫度差異小于0.1℃，能很好的維持樣品間的溫度一致性。

2.在細(xì)胞進(jìn)入水浴鍋解凍前，務(wù)必將凍存管豎直立在桌面上10~20s，這樣之后，可以排空可能存在在凍存管蓋縫隙內(nèi)的液氮。尤其是外旋蓋的凍存管，特別要注意！不然在水浴解凍的時(shí)候有概率會(huì)砰的一聲爆發(fā)出來(lái)！極為危險(xiǎn)。

3.將凍存管在37℃水浴鍋內(nèi)水浴解凍，因?yàn)镈MSO在常溫情況下對(duì)細(xì)胞有毒副作用，若解凍時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷并影響其存活率，所以一定要快，解凍過(guò)程在1~2min內(nèi)完成。

4.解凍完成后，在生物安全柜內(nèi)，用自動(dòng)旋蓋機(jī)打開(kāi)凍存管，之后在移液槍將凍存管內(nèi)細(xì)胞復(fù)懸，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5~10ml培養(yǎng)基的離心管中，1000rmp離心5min（根據(jù)各自細(xì)胞的特新調(diào)整離心力和離心時(shí)間）。如果沒(méi)有培養(yǎng)基稀釋?zhuān)陔x心過(guò)程中較高濃度的DMSO會(huì)對(duì)細(xì)胞損傷，影響細(xì)胞存活率！

5.丟棄上清，里面還有DMSO和死去細(xì)胞的裂解產(chǎn)物，這不是我們所需要的。將剩余的細(xì)胞用培養(yǎng)基稀釋復(fù)懸，稀釋比例為1:10~1:15，再按照大家各自實(shí)驗(yàn)需求，分裝到100mm培養(yǎng)皿或者T25瓶中，顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。03復(fù)蘇后的注意點(diǎn)

復(fù)蘇后記得每天都要觀察細(xì)胞狀態(tài)，及時(shí)更換培養(yǎng)基，確保細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)的充足和生長(zhǎng)環(huán)境的清潔。附：可使用到的耐思產(chǎn)品

移液管

無(wú)冰冰盒

T25培養(yǎng)瓶

盒裝無(wú)菌吸頭

100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿