細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)實驗的步驟和方法

———細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)實驗的步驟和方法

細胞計數(shù)是確定培養(yǎng)中鋪板的細胞濃度、確定細胞活力和評估細胞分離程序結(jié)果的一個組成部分。建議在細胞分離之前進行初始細胞計數(shù)；然后可以將該數(shù)字與細胞分離后的細胞計數(shù)進行比較，以計算細胞恢復率。此外，當預期細胞活力可能會降低時，應進行活細胞計數(shù)，例如，在處理冷凍保存的細胞或離體操作的細胞時。本文描述了如何使用3%乙酸和亞-CH3藍進行總有核細胞計數(shù)，以及如何通過臺盼藍染料排除進行活細胞計數(shù)。

實驗步驟和方法：

I部分：樣品制備

選項1：用3%乙酸和亞-CH3藍對總有核細胞計數(shù)進行細胞稀釋

使用磷酸鹽緩沖鹽水或無血清培養(yǎng)基對充分混合的單細胞懸浮液進行適當稀釋。為了準確表示濃度，請使用至少20L的細胞懸浮液進行稀釋。

示例：制備10倍稀釋液

在微量離心管或96孔板的孔中加入180L的3%乙酸和亞-CH3藍?；旌霞毎麘腋∫?，將20L添加到含有3%乙酸和亞-CH3藍的試管或孔中。

選項2：通過臺盼藍染料排除對活細胞計數(shù)進行細胞稀釋

確保要計數(shù)的細胞懸浮液*重新懸浮。在細胞沉降之前，將適量的細胞懸液(20-200L)放入離心管中。加入等體積的0.4%臺盼藍并輕輕混合。將混合物在室溫(15C25C)下孵育5分鐘。

II部分：使用血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)

通過用70%C2H6O清潔腔室表面來制備血細胞計數(shù)器。擦干。將蓋玻片放在腔室上。

使用20L移液器重新懸浮細胞混合物，并將10L的染色細胞放入血細胞計室。

注意：小心不要移動蓋玻片。允許毛細作用將樣品吸入。

將血細胞計數(shù)器放在雙目光學顯微鏡的載物臺上。將顯微鏡調(diào)整到10倍放大倍率并聚焦在細胞上。

使用手動計數(shù)計數(shù)器，計算血細胞計數(shù)器四個外部正方形中的每一個中的細胞（染色的細胞核）（圖1A），包括位于底部和左側(cè)周邊的細胞，但不包括位于頂部和右手邊（圖1B）。如果在第一部分中使用了3%乙酸和亞-CH3藍，則計算染色的細胞核。如果在第一部分中使用了臺盼藍，則計算未染色的活細胞。

細胞計數(shù)儀

血細胞計數(shù)器圖指示（A）四組紅色和（B）其中一組應用于計數(shù)的16個方塊。

注意：適當?shù)南♂屜禂?shù)將取決于起始樣本中存在的大致細胞數(shù)量，但應使血細胞計數(shù)器中的細胞濃度為每平方（即大或主要正方形）50-100個細胞。如果血細胞計數(shù)器上每個主要正方形的細胞多于或少于大約100個，請使用更大或更小的稀釋因子制備新的稀釋樣品。

血細胞計數(shù)器的九個主要方塊中的每一個都代表0.1mm3的總體積。由于1cm3相當于1mL，因此可以使用以下等式確定細胞濃度：

有核細胞總數(shù)/mL=每平方平均細胞數(shù)x稀釋因子x104

示例：如果四個外部方塊中的每一個的細胞計數(shù)在100稀釋因子下分別為21、15、20和17，則平均細胞計數(shù)將為(21+15+20+17)4=18.25。

因此，原始懸浮液中細胞的總濃度為：18.25x100x10^4=18,250,000個細胞/mL。

使用人工的細胞計數(shù)方法誤差率較高，為提高細胞計