選修一微生物的實驗室培養(yǎng)

選修一微生物的實驗室培養(yǎng)第1頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)基可以分為哪幾類？培養(yǎng)基一般都含有哪些營養(yǎng)物質(zhì)，此外還要滿足哪些要求？獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是什么？什么是消毒、滅菌，常用方法有哪些？制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的方法步驟？

學(xué)習(xí)目標(biāo)如何倒平板？第2頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二微生物的類群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌如草履蟲、單細胞藻類等無細胞結(jié)構(gòu)真核細胞細菌、藍藻原核細胞？第3頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二第4頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二一、培養(yǎng)基1.概念：人們按照微生物對_________的不同需求，配置出供其____________的營養(yǎng)基質(zhì)。營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖2.培養(yǎng)基的類型和用途按物理性質(zhì)固體培養(yǎng)基:加瓊脂；用于分離、鑒定、計數(shù)液體培養(yǎng)基：不加凝固劑；用于工業(yè)生產(chǎn)。半固體培養(yǎng)基：加少量瓊脂；可用于保藏菌種。第5頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二按化學(xué)成分合成培養(yǎng)基：成分明確；分類鑒定。天然培養(yǎng)基：成分不明確；用于工業(yè)生產(chǎn)。按目的用途分鑒別培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，區(qū)別出不同類型的微生物。選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某一種或一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢怼⒒瘜W(xué)抗性設(shè)計培養(yǎng)基。如用青霉素選出酵母菌等。第6頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基應(yīng)用加入青霉素分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽分離金黃色葡萄球菌不加氮源分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素分離導(dǎo)入了目的基因的受體細胞在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其它種類微生物生長的培養(yǎng)基。第7頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二鑒別培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點在培養(yǎng)基加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成，用以鑒別不同的微生物只起鑒別作用，并不能抑制其他微生物

第8頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基第9頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)基一般都含有哪些營養(yǎng)物質(zhì)，此外還要滿足哪些要求？第10頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。第11頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二一.培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)1.基本成分：碳源、氮源、水、無機鹽⑴碳源無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機氮源：有機氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：對于異養(yǎng)微生物，含C、N的化合物既為碳源，也是氮源。第12頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g第13頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)基配制原則⑴目的明確：⑵營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng)⑶適宜的pH值：有機碳源異養(yǎng)型：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇原料自養(yǎng)型：不加碳源加入緩沖劑（CO2碳源）生產(chǎn)科研第14頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二2.無菌范圍：實驗操作空間消毒操作者的手、衣著消毒實驗用具滅菌實驗操作過程二.無菌技術(shù)：防止外來雜菌的污染1.消毒與滅菌：酒精燈旁操作超凈工作臺第15頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二二、無菌操作技術(shù)1.獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵？防止外來雜菌入侵2、無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？避免操作者自身被微生物感染第16頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二消毒與滅菌消毒：使用較溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。滅菌：使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。第17頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二芽孢

有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。每一細胞僅形成一個芽孢，所以其沒有繁殖功能。細菌、原生動物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的生殖細胞。能直接發(fā)育成新個體。孢子——特殊的休眠構(gòu)造第18頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二消毒的方法：1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線適用對象：操作空間、液體、雙手等第19頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二滅菌的方法：1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.第20頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手思考消毒滅菌滅菌第21頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二練習(xí)：思考并討論下面的儀器分別用什么樣的消毒和滅菌方法？培養(yǎng)基培養(yǎng)皿空氣接種環(huán)雙手牛奶②巴氏消毒③化學(xué)消毒⑤紫外線消毒⑥高壓蒸氣滅菌①灼燒滅菌④干熱滅菌第22頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二單個或少數(shù)菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功能：1.定義：三、菌落鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細胞群體第23頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g四.大腸桿菌的純化培養(yǎng)㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計算：培養(yǎng)基用量依配方計算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂→補水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿第24頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二倒平板約50℃防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基第25頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論

答：用手觸摸，剛不燙手。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第26頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：皿蓋凝結(jié)水珠，防止水珠落入培養(yǎng)基，造成污染；平板倒置，防止培養(yǎng)基表面的水分揮發(fā)。

答：最好不用，空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。第27頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二二.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：⑴平板劃線法：菌種劃3個平板1個不劃線1.接種：接種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基（重復(fù)實驗）（空白對照）第28頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二問題2：每次劃線前灼燒接種環(huán)的目的：問題3：劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)的目的：避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)基殺死上次劃線結(jié)束后殘留的菌種及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免污染環(huán)境和操作者。問題1：第一步灼燒接種環(huán)的目的：問題討論第29頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。第30頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二4.為什么不能劃破培養(yǎng)基？一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。第31頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液第32頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過0.1ml各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照滴灼試涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍第33頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二⑴平板劃線法：二.大腸桿菌的純化培養(yǎng)：㈠制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基㈡純化大腸桿菌：1.接種：⑵稀釋涂布平板法：2.培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h后，觀察并記錄第34頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二微生物的培養(yǎng)與觀察第35頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征

在普通瓊脂培養(yǎng)基上：圓形，邊緣整齊，表面光滑，半透明。典型的大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂平板上的特征為:深紫黑色、光滑、濕潤、帶有金屬光澤的圓形菌落。第36頁，共38頁，2023年，2月20日，星期二1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？

2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀