生化分析實驗圓盤電泳

生化分析實驗圓盤電泳第1頁/共26頁簡述聚丙烯酰胺凝膠聚合的原理，如何調節(jié)凝膠的孔徑?2.為什么樣品會在濃縮膠中被壓縮成層？3.為什么在樣品中加含有少許溴酚藍的40％蔗糖溶液？蔗糖及溴酚藍各有何用途？4.上下兩槽電泳緩沖液電泳后，能否混合存放？為什么？5.根據實驗過程的體會，總結如何做好聚丙烯酰胺垂直板電泳？哪些是關鍵步驟？6.如何除去凝膠中過量的AP？未反應的單體如何除去？

第2頁/共26頁一、目的要求1.學習聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳原理和技術2.學習和掌握圓盤電泳分離蛋白質技術第3頁/共26頁二、原理

聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳和垂直平板電泳具有相同的原理。不連續(xù)：凝膠孔徑不連續(xù)性；緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性；電位梯度的不連續(xù)性：三種效應：樣品濃縮效應；分子篩效應；電荷效應第4頁/共26頁聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳（左）和圓盤電泳（右）示意圖它們各有什么不同，各自的優(yōu)缺點是什么？

第5頁/共26頁垂直平板：

1、多個樣品在同一塊凝膠上，電泳條件一致－－便于利用各種鑒定

方法，直接比較各種樣品區(qū)帶，保證結果的準確可靠

2、可以進行雙向電泳

3、電泳時熱量容易消散，凝膠結果便于照相和易于制成干膠

圓盤電泳：

1、缺點是由于聚合效應，凝膠的長度和直徑有細微差別，即使同一

樣品在兩個凝膠柱上以同樣的條件電泳，其結果也會不同

2、但是研究工作中還會用到圓盤電泳，例如測定放射性標記的樣品

測定蛋白質的生物活性；測定蛋白質分離的最適pH，凝膠濃度；

雙向電泳中第一相的分離。

第6頁/共26頁圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品膠pH6.9(2)濃縮膠pH6.9

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

第7頁/共26頁三、試劑的配制：

1、電極Buffer的配制：每排派一個同學配一份

2、樣品溶液，染色液都已由實驗室的老師配好了。

3、脫色液可在電泳的時候配制第8頁/共26頁四、凝膠的配制：（1）、分離膠[7.5%]貯液的配制：A：稱取Tris.3.7g；加1.0mol/LHCL4.8ml；TEMED100μl；最后加蒸餾水至10ml；pH8.9即可。(TEMED最后在分離膠的混合液中加10μl）

B：分別稱取Acr3.0g；Bis0.08g；加蒸餾水至10.0ml溶解、混勻即可。C：稱取過硫酸銨(AP)0.028g；加蒸餾水至10.0ml溶解、混勻即可。D：蒸餾水分別?。篈：B：C：D=1.0ml：2.0ml：4.0ml：1.0ml（8.0ml）第9頁/共26頁（2）、濃縮膠[2.5%]貯液的配制：E：稱取Tris.0.958g；加1.0mol/LHCL4.8ml；TEMED200μl

；最后加蒸餾水至10.0ml；pH6.9即可。

(TEMED最后在濃縮膠的混合液中加20μl

）

F：分別稱取Acr1.0g；Bis0.25g；加蒸餾水至10.0ml溶解、混勻即可。G：稱取蔗糖4.0g；加蒸餾水至10.0ml溶解、混勻即可。H：稱取過硫酸銨(AP)0.028g；加蒸餾水至10.0ml溶解、混勻即可。分別?。篍：F：G：H=0.5ml：1.0ml：0.5ml：2.0ml（4.0ml）第10頁/共26頁五、操作步驟

1、分離膠的制備：（1）、將清潔、無破碎干燥的小玻管一端（同學們應該挑選一下比較平的那頭），用膠布貼封后，朝下垂直放入有機玻璃凝膠玻管架的孔中，并在小玻管的7.0cm處作一記號。（2）、用自動取液器吸取上述配好的分離凝膠貯液沿著小玻管內壁小心準確加入7.0cm高。（3）、凝膠溶液加畢后，隨即吸取蒸餾水，加至管中的凝膠表面，使其表面覆蓋一水層（水封，1.0cm高）。在灌膠和封水的過程中，操作要輕，以避免產生氣泡。（4）、將加注好的凝膠管于室溫下靜置，以進行聚合反應，在正常情況下大約30-60分鐘后，待界面出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象時，表明膠已聚合完畢，即可加濃縮膠。第11頁/共26頁2、濃縮膠的制備：（1）、輕輕倒掉分離膠玻管上端的液體，并用吸水紙吸去未倒凈的液體（但不能觸及膠面）然后先小心用濃縮膠貯液洗滌凝膠表面1-2次，再小心加入該濃縮膠貯液1.5cm高。（2）、隨后同樣加1.0cm高的蒸餾水層覆蓋膠表面。大約也在20-40分鐘后，待濃縮膠出現(xiàn)乳白色時，表明膠已聚合完畢。第12頁/共26頁3、加樣：取一根上次做好的凝膠小玻管用吸水紙輕輕吸去濃縮膠表面上的水層，然后用微量注射器加10ul測試樣品溶液。第13頁/共26頁4、裝置凝膠管：將加好樣品的凝膠管的加樣端（上端），插入上電泳槽孔中，然后將已插滿凝膠管的上電泳槽放入加有電極溶液的下電泳槽內。此時凝膠玻管下端管口易產生氣泡，可通過輕輕擺動凝膠玻管以去除氣泡，插入上電泳槽的玻管上端，用滴管輕輕滴滿電極溶液，以免產生氣泡，最后將上電泳槽裝滿電極液。第14頁/共26頁5、接通電源：接通電泳槽的兩端電極與電泳儀的電源，上槽電極接負極，下槽電極接正極，穩(wěn)壓300V電泳開始時，電流應由小逐步加大至額定值。這時的電流大約每管3.0-5.0mA電流，直至指示劑前沿到達凝膠管底部約0.5cm處，（大約需時2小時），停止電泳。確定電泳結束時，不應將溴酚蘭跑出凝膠管，以防止標準分子量中的最低分子量蛋白質也跑出凝膠管。第15頁/共26頁6、練習取出玻管內的凝膠：將一支帶有長針頭的注射器吸有適量水（蒸餾水或自來水），把針頭慢慢插入玻管內壁和凝膠柱表面之間，一邊開始壓水，一邊同時使針頭慢慢貼緊管壁呈螺旋式前進，如果一端不行，再在管的另一端按同樣的方法剝離，這樣依靠水流的壓力和滑潤力，使玻管內壁與凝膠分離，最后用洗耳球在管的一端輕輕擠壓，另一端對著一干凈大小適宜的培養(yǎng)皿內，此時可以將凝膠柱壓出玻管。第16頁/共26頁7、取出玻管內的凝膠：8、凝膠染色：

將取出的凝膠柱，放入一合適干凈的培養(yǎng)皿內，然后加入適量染色液，于搖床上進行振搖染色30分鐘，完畢，回收染色液，用清水洗凝膠柱2-3遍。在染色的同時，凝膠中蛋白質區(qū)帶亦被固定。第17頁/共26頁9、凝膠脫色：在培養(yǎng)皿（或試管）內加入適量脫色液于搖床上進行振搖（2小時/次，需3次）脫色多次直至色帶完全清晰為止。第18頁/共26頁10、繪圖：最后根據染色所出現(xiàn)的帶數和位置進行繪圖，以確定被分析樣品的組分。另一種方法是通過密度掃描儀掃出各組分的峰形位置，這樣不僅能確定組分，而且能比較出各組分所占比例（如果要計算出各分離區(qū)帶的相對遷移率，可參考教課書）。第19頁/共26頁注意事項Acr和Bis有神經毒性，可經皮膚、呼吸道等吸收，故操作時要注意保護。

沒有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近，實驗中全部的膠統(tǒng)一放到指定的容器中，由專門的人收集到一起，統(tǒng)一處理。各種廢液請集中在指定的容器中（第一組的水池邊的桶）第20頁/共26頁友情提示:

分離膠:7.0CM

濃縮膠:1.5CM

上樣量:10ul

穩(wěn)壓:300V

電泳時間:1:30小時染色時間:30分鐘大家在等凝膠聚合的時候，可以觀察和記錄上次垂直平板電泳的結果。第21頁/共26頁討論題1、在利用預電泳除去未反應完全的單體時，在不連續(xù)電泳體系中，預電泳只能在分離膠聚合后進行，洗凈膠面后才能制備濃縮膠。濃縮膠制備后，不能進行預電泳，為什么？第22頁/共26頁討論題2、電解液中的離子強度有