實(shí)驗(yàn)二微量凱氏定氮法測定總氮量課件

實(shí)驗(yàn)二總氮量的測定―凱氏定氮法一目的：學(xué)習(xí)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的原理掌握蒸餾、滴定操作技術(shù)二、原理生物材料的含氮量測定在生物化學(xué)研究中具有一定的意義，蛋白質(zhì)的含氮量約為16％，測出含氮量則可推知蛋白含量。消化：有機(jī)物與濃硫酸供熱，使有機(jī)氮全部轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮——硫酸銨。為加快反應(yīng)，添加硫酸銅和硫酸鉀的混合物；前者為催化劑，后者可提高硫酸沸點(diǎn)。甘氨酸的消化過程可表示如下：

CH2NH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2十4H2O十NH3

2NH3+H2SO4(NH4)2SO4蒸餾：濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氫離子濃度降低，(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O滴定：用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來的氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾數(shù)(相當(dāng)于待測物中氨的摩爾數(shù))計(jì)算出待測物中的總氮量。(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O(NH4)2SO4+4H3BO3本法適用于0.2~2.0mg的氮量測定。三、試劑

1、濃硫酸2、粉末硫酸鉀―硫酸銅混合物

K2S04與CuS04.5H20以3：1配比研磨混合3、30％氫氧化鈉溶液4、2％硼酸溶液5、標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液(0.0098mol／L)6、混合指示劑(田氏指示劑)

由50mL0．1％甲烯藍(lán)乙醇溶液與200mL0．1％甲基紅乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶中備用。酸性時(shí)為紫紅色，堿性時(shí)為綠色。變色范圍很窄且靈敏。7、樣品—面粉1g2、消化取凱氏燒瓶標(biāo)號。各加幾顆玻璃珠;在1及2號瓶中各加樣品0.1g，催化劑(K2S04+CuS04.5H2O)200mg，濃硫酸5mL。在3及4號瓶中各加相同量的催化劑和濃硫酸，作為對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)。每個(gè)瓶口放―漏斗，在通風(fēng)櫥內(nèi)的電爐上消化。注意加樣品時(shí)應(yīng)直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。

消化開始時(shí)應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明淡綠色為止。定容：冷卻后，加蒸餾水約10mL。(注意慢加，隨加隨搖)。然后將瓶中溶物傾入50或100mL的容量瓶中，并以蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，將洗液并入容量瓶，用水稀釋到刻度，混勻備用。

蒸餾:改進(jìn)型凱氏定氮儀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：將蒸汽發(fā)生器、蒸餾器和冷凝器組成一個(gè)整體，體積小，安裝容易，操作簡便。

(1)水蒸汽發(fā)生器和反應(yīng)室(2)冷凝器和通氣室(3)排水柱關(guān)鍵:搞清水管系統(tǒng)

蒸餾器的洗滌１．

接通冷凝水，先向蒸汽發(fā)生器中加入一定量的水(以排水口高度為宜)。２．水的自動噴出：將蒸餾水由加樣室加入反應(yīng)室，加樣口水封，用酒精燈將其加熱燒開將酒精燈移開片刻，反應(yīng)室內(nèi)水自動噴出到蒸汽發(fā)生器打開蒸汽發(fā)生器出水口，放水。如此反復(fù)清洗3-5次。３．清洗后在冷凝管下端放一錐形瓶盛有5mL，2％硼酸溶液和1～2滴指示劑的混合液。打開冷凝水，進(jìn)行蒸餾，如3-5min不變色則表明蒸餾裝置內(nèi)部已洗滌干凈。

3蒸餾過程：準(zhǔn)備:取50mL錐形瓶3個(gè)，各加入5mL2％硼

酸溶液和1―2滴指示劑，溶液呈淡紫色，用表面皿覆蓋備用。打開冷凝水，置換成冷水。將一個(gè)盛有硼酸和指示劑溶液的錐形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸沒在液體內(nèi)。加樣:用移液管取5mL消化液（空白液和消化液分別做），細(xì)心地加入反應(yīng)室，隨后用小量筒加入30％NaOH溶液5mL，關(guān)閉自由夾，在加樣漏斗中加少量水做封口。蒸餾:關(guān)閉自由夾，打開冷凝水(注意不要過快過猛，以免水溢出,實(shí)驗(yàn)過程中，冷凝水可一直打開)。點(diǎn)燃酒精燈，蒸餾開始，當(dāng)觀察到錐形瓶中的溶液由淡紫色變綠時(shí)(約2―3分鐘)，開始計(jì)時(shí)，蒸餾3分鐘，移開錐形瓶，使冷凝器下端離開液面約1cm，同時(shí)用少量蒸餾水洗滌冷凝管口外側(cè)，繼續(xù)蒸餾1分鐘，取下錐形瓶，用表面皿覆蓋瓶口。蒸餾完畢后，應(yīng)立即清洗反應(yīng)室，方法如前所述。如此3～5次。最后將自由夾同時(shí)打開，將蒸汽發(fā)生器內(nèi)的全部廢水換掉，繼續(xù)下一次蒸餾。待樣品和空白消化液均蒸餾完畢，同時(shí)進(jìn)行滴定。5.計(jì)算總氮量(%)=C(V1-V2)×0.014×100×

消化液量(ml)/滴定消耗用液量(ml)×wc為標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液摩爾濃度(0.0098M)；V1為滴定樣品消化液用去的鹽酸溶液平均mL數(shù)；V2為滴定空白消化液用去的鹽酸溶液平均mL數(shù)；w為樣品重量(1g),消化液量500ml,滴定消耗用液量5ml。14為氮的相對原子質(zhì)量。樣品蛋白質(zhì)含量(％)=總氮量×6.25思考題