SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳課件

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳主要內(nèi)容實驗?zāi)康?/p>

實驗原理

實驗材料和試劑

實驗步驟

結(jié)果處理實驗?zāi)康牧私怆娪緦嶒炘碚莆针娪緦嶒灢僮饕?guī)程用電泳方法測定蛋白分子量SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)表明，它們在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形狀的長橢園棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣（約為18?，即1.8nm），而長軸則隨蛋白質(zhì)分子量成正比地變化。這樣的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是橢園棒的長度也就是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離笵圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。在沒有交聯(lián)劑的情況下聚合的丙烯酰胺形成毫無價值的粘稠溶液，而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后凝膠的剛性和抗張強度都有所增加，并形成SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物必須通過的小孔。這些小孔的孔徑隨“雙丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而變小，比率接近1：20時孔徑達到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺～丙烯酰胺”為1：29配制，試驗表明它能分離大小相差只有3%的蛋白質(zhì)。凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數(shù)。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝膠的線性分離范圍如下表：丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（kD）

1512～431016～687.536～945.057～212雙丙烯酰胺～丙烯酰胺摩爾比為1：29。實驗材料和試劑試劑丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺十二烷基硫酸鈉（SDS）用于制備分離膠和積層膠的Tris緩沖液TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)過硫酸銨Tris-甘氨酸電泳緩沖液樣品處理液（50mMTris-HCl(pH6.8)，100mMDTT(or5%巰基乙醇)，2%SDS，0.1%溴酚藍，10%甘油）染色液（0.1%考馬斯亮藍R250，40%甲醇10%冰醋酸）脫色液（10%甲醇，10%冰醋酸）聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠,立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。在等待濃縮膠聚合時，可對樣品進行處理，在樣品中按1:1體積比加入樣品處理液，在100℃加熱3分鐘以使蛋白質(zhì)變性。濃縮膠聚合完全后（30分鐘），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電極緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。按予定順序加樣，加樣量通常為10～25μl（1.5mm厚的膠）。將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/cm。當(dāng)染料前沿進入分離膠后，把電壓提高到15V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部上方約1cm，然后關(guān)閉電源。從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。3.用考馬斯亮藍對SDS聚丙烯酰胺凝膠進行染色經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品可用考馬斯亮藍R250染色。染色1～2小時或過夜。4.換脫色液脫色，需3～10小時，其間更換多次脫色液至背景清楚。此方法檢測靈敏度為0.2～1.0mg。脫色后，可將凝膠浸于水中，長期封裝在塑料袋內(nèi)而不降低染色強度。為永久性記錄，可對凝膠進行拍照，或?qū)⒛z干燥成膠片。