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文檔簡介

生物合成的學習材料第1頁/共111頁DNA復制的概念:以DNA為模板,以4種dNTP為原料,在DNA聚合酶的作用下合成與模板互補的DNA分子的過程。

DNA復制是在細胞分裂前進行的。DNA通過自我復制生成2個與原來分子完全相同的DNA分子,細胞分裂后分別進入兩個子細胞中,這樣就把遺傳信息由親代DNA分子傳給子代DNA分子。第2頁/共111頁第3頁/共111頁n1dATPn1dTTPn2dGTPn2dCTP+++++DNA2DNAdAMPdTMPdGMPdCMP2(n1+n2)PPiDNA聚合酶、DNA連接酶、引物酶、解旋酶、單鏈結合蛋白等。第4頁/共111頁DNA復制方式:半保留復制(semiconservativereplication)。DNA在復制時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開,然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈,這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA,另一條鏈是新合成的,這種復制方式為半保留復制。

第5頁/共111頁DNAReplicationissemiconservative

EachDNAstrandservesastemplateforthesynthesisofanewstrand,producingtwonewDNAmolecules,eachwithonenewstrandandoneoldstrand.ThisissemiconservativereplicationMeselsonandStahl(In1957)第6頁/共111頁

第一節(jié)

參與DNA復制的主要酶類與蛋白因子(DNA復制系統(tǒng))一、原核生物

拓撲異構酶(topoisomerase)是一類可改變DNA拓撲性質的酶。在DNA復制時,復制叉行進的前方DNA分子部分產生正超螺旋,拓撲異構酶可松弛正超螺旋,還可以引入負超螺旋,有利于復制叉的行進及DNA的合成。在復制完成后,拓撲異構酶又向DNA分子引入負超螺旋,有利于DNA纏繞、折疊、壓縮以形成染色質。DNA拓撲異構酶主要有Ⅰ和Ⅱ兩種類型:

拓撲異構酶I:

它可使DNA的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接,反應無需供給能量。另外,DNA復制時負超螺旋的消除,亦由拓撲異構酶Ⅰ來完成,但它對正超螺旋無作用;

第7頁/共111頁

拓撲異構酶Ⅱ:又稱為旋轉酶(gyrase),由兩個A亞基和兩個B亞基組成,即A2B2。它能使DNA的兩條鏈同時發(fā)生斷裂和再連接,當它引入負超螺旋以消除復制叉前進帶來的扭曲張力時,需要由ATP提供能量。兩種拓撲異構酶在DNA復制、轉錄和重組中均發(fā)揮重要作用。第8頁/共111頁

解旋酶(Helicase,DnaB):也稱為解鏈酶。在復制叉處在其它因子的參與下利用水解ATP將DNA雙股鏈解開。其它因子主要包括:DnaA,識別大腸桿菌復制原點OriC,啟動解鏈過程;DnaC,幫助解鏈酶(DnaB)結合

每解開一對堿基,需要水解2分子ATP。解旋酶不只有一種,還有參與轉錄、DNA修復、DNA重組等過程的解旋酶。

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單鏈DNA結合蛋白(singlestrandbindingprotein,SSBprotein):與解開的DNA單鏈結合,防止堿基對的重新結合。大腸桿菌的SSB蛋白由4個相同亞基構成,其功能在于穩(wěn)定解開的DNA單鏈,阻止DNA復性和保護單鏈部分不被核酸酶降解。原核生物的SSB蛋白與DNA的結合表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應:當第一個分子結合后,其他分子與DNA的結合能力可提高103倍。因此一旦結合反應開始,即迅速擴展,直至全部單鏈DNA都被SSB蛋白覆蓋。SSB蛋白可以重復利用

第10頁/共111頁解旋酶拓撲異構酶第11頁/共111頁

引物酶(primase,DnaG):又稱引發(fā)酶,一種特殊的RNA聚合酶,用于合成RNA引物。已知DNA聚合酶催化DNA片段的合成要求一段與模板互補、帶有3-OH的DNA或RNA片段作引物。Ecoli是由dnaG基因編碼。該酶分子量約為60000,該酶單獨存在時相當不活潑,只有與其他蛋白質相互作用結合成一個復合體時才有活性,這種復合體稱為引發(fā)體(primosome)。合成的引物是長約5~10個核苷酸的RNA。一旦RNA引物合成,就可以由DNA聚合酶Ⅲ在它的3′-OH上繼續(xù)催化DNA新鏈的合成。

第12頁/共111頁DNA聚合酶(DNApolymerase)是以DNA為模板,催化底物(dNTP)合成DNA的酶類,普遍存在于生物體內。它們的作用方式基本相同,都需要dNTP、Mg2+、模板DNA和引物,在DNA模板指導下,催化底物加到引物的3′-OH上,形成3′,5′磷酸二酯鍵,由5′→3′方向延長DNA鏈,見下圖。引物是DNA合成所必需的。第13頁/共111頁大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ由一條分子量為101000的單一多肽鏈組成,多肽鏈中含有一個鋅原子。每個大腸桿菌細胞約有400個分子的DNA聚合酶Ⅰ。DNA聚合酶Ⅰ的功能如下:①5’→3’聚合酶活性,即當底物和模板存在時,DNA聚合酶Ⅰ可使脫氧核糖核苷酸逐個加到引物的3′-OH末端的多核苷酸鏈上,在37℃條件下,每分子DNA聚合酶Ⅰ每分鐘可以催化大約1000個脫氧核苷酸的聚合;②5’→3’外切酶活性,它可以及時切除復制起始合成的RNA引物;③3’→5’外切酶活性,起校對功能,它可以切除聚合上去的錯誤核苷酸,從而可使復制的忠實性提高1000倍。DNA聚合酶Ⅰ可以被蛋白酶切成2個片段,大片段(68000)稱為Klenow,具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性,是分子生物學研究中常用的工具酶。小片段(35000)具有5′→3′外切酶活性,可以切除少量的核苷酸。第14頁/共111頁

DNA聚合酶Ⅱ為多亞基酶,由分子量約為88000的多肽鏈組成,其活力比DNA聚合酶Ⅰ高,每分鐘可催化約2400個核苷酸的聚合。DNA聚合酶Ⅱ具有5′→3′聚合酶活性外,也有3′→5′核酸外切酶活性,但無5′→3′外切酶活性。它也只是修復酶,而非真正的復制酶。第15頁/共111頁

DNA聚合酶Ⅲ:被認為是真正的DNA復制酶(replicase),全酶由α、β、γ、ε、θ、τ、ψ、χ、δ、δ`等10種亞基組成,也含有鋅原子,分子量大約900000,以二聚體起作用。α亞基主要有5′→3′聚合活性,ε亞基具有3′→5′核酸外切酶活性,2個β亞基充當“滑動夾子”,它通過γ復合物夾子載體組裝到DNA上,此步驟需要ATP。2個β亞基圍繞雙螺旋形成一個環(huán),以利于聚合酶沿著模板滑動。正是由于DNA聚合酶Ⅲ的組成復雜,使它具有了強催化活性、忠實性、持續(xù)性。DNA聚合酶Ⅲ可連續(xù)催化幾千個磷酸二酯鍵的形成。所以它催化的合成速度達到了體內DNA合成的速度。它還有3′→5′核酸外切酶活性,使得復制的忠實性由7×10-6提高至5×10-9,但DNA聚合酶Ⅲ無5′→3′外切活性。第16頁/共111頁表

13?1大腸桿菌三種DNA聚合酶的性質比較DNA

聚合酶Ecoli:DNApolymeraseI,II,III,IV,VDNApolyI:具有5’→3’聚合、5’→3’外切、3’→5’外切活性,主要參與DNA修復,切除引物;DNApolyII:與DNApolyI功能相似;但沒有5’→3’外切酶活性DNApolyIII:DNA合成。具有5’→3’聚合、3’→5’外切活性,沒有5’→3’外切酶活性DNApolyIVandV:1999發(fā)現(xiàn),涉及DNA錯誤傾向修復。真核生物:DNApolymeraseα,β,γ,δ,ε1.DNApolyα:DNA合成

2.DNApolyβ:DNA修復

3.DNApolyγ:線粒體DNA合成

4.DNApolyδ:

DNA合成

4.DNApolyε

:DNA修復第17頁/共111頁DNA連接酶(DNAligase):大腸桿菌DNA連接酶是一條分子量約為74000的多肽,每個大腸桿菌細胞含有約300個連接酶分子。它催化雙鏈DNA切口處的5′-磷酸基和3′-羥基生成磷酸二酯鍵,反應需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)提供能量,并釋放出煙酰胺單核苷酸(NMN)。在真核生物中DNA連接酶則需要ATP。DNA連接酶在DNA的復制、修復和重組等過程中均起重要作用。第18頁/共111頁二、真核生物拓撲異構酶Ⅰ(topoisomerase):真核生物的是分子量約為95000的單體蛋白。雖然它所催化的反應與原核生物的酶相似,但它同樣能使正、負超螺旋DNA松弛。松弛作用不依賴于ATP,能發(fā)生于有EDTA存在的條件下,Mg2+能提高該酶的活力。拓撲異構酶Ⅱ為150000~180000的均二聚體,能以同樣的速率松弛正、負超螺旋DNA;與原核生物不同的是,真核生物拓撲異構酶Ⅱ不能產生負超螺旋,發(fā)揮作用時需要ATP和Mg2+。

第19頁/共111頁DNA聚合酶(DNApolymerase)真核生物有多種。哺乳動物有5種DNA聚合酶:

DNApolymeraseα、

DNApolymeraseβ、

DNApolymeraseγ、

DNApolymeraseδ、

DNApolymeraseε

它們與大腸桿菌DNA聚合酶的基本性質相同,都是以4種脫氧核糖核苷三磷酸為底物,需Mg2+激活,聚合時必須有模板和3′-OH的存在,鏈的延伸方向為5′→3′。第20頁/共111頁細胞核染色體的復制由DNA聚合酶α和δ共同完成。DNA聚合酶α為多亞基酶,其中一個亞基具有引物合成酶活性,最大的亞基具有聚合酶活性,無外切酶活性的亞基。DNA聚合酶δ既有持續(xù)合成DNA鏈的能力,又有校正功能,由它完成DNA的復制。DNA聚合酶ε可能相當于細菌的DNA聚合酶Ⅰ,它是一種修復酶,參與DNA的修復合成,并存在于復制叉處,用以取代滯后鏈岡崎片段的引物。DNA聚合酶β也是修復酶。DNA聚合酶γ是線粒體DNA的合成酶。第21頁/共111頁復制蛋白A(replicationproteinA,RP-A)是真核生物的單鏈DNA結合蛋白,其作用類似于大腸桿菌的SSB蛋白。

復制因子C(replicationfactorC,RF-C)是夾子裝置,相當于大腸桿菌的γ復合物,它控制滯后鏈上酶的結合與脫離。第22頁/共111頁

端粒(telomere)是真核生物線性染色體末端的特殊結構,它由成百個6個核苷酸的重復序列所組成(人的是TTAGGG,四膜蟲為TTGGGG)。端粒的功能是穩(wěn)定染色體的末端結構,防止染色體間末端連接,并可補償滯后鏈5′-末端在消除RNA引物后造成的空缺。復制可使端粒5′末端縮短,而端粒酶(telomerase)可外加重復單位到5′-末端上,結果使端粒維持一定的長度。

真核生物的端粒酶是一種含有RNA鏈的逆轉錄酶,它以自身所含的RNA為模板來合成DNA的端粒結構。通常端粒酶是含約150個核苷酸的RNA鏈,其中含1.5個拷貝的端粒重復單位的模板。端粒酶可結合到端粒的3′末端上,每次都是RNA模板的5′末端堿基(CCCCAACCCCAA)識別DNA的3′末端堿基(TTGGGGTTGGGG)并相互配對,以RNA鏈為模板使DNA鏈延伸,合成一個重復單位后酶再向前移動一個單位。端粒的3′單鏈末端可回折作為引物,合成其互補鏈。

第23頁/共111頁第24頁/共111頁第二節(jié)DNA的復制過程一、DNA復制的起始點和方向

復制原點(originofreplication,Ori),復制叉(replicationfork)或稱為生長點(growingpoint)復制眼(replicationeye)由于大腸桿菌的DNA是雙鏈環(huán)狀,在鏡下可觀察到θ形結構。大腸桿菌只有一個復制原點。

真核生物的一條染色體DNA中,有多個復制原點。

第25頁/共111頁5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復制子3’第26頁/共111頁參與DNA復制的物質

底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶,簡寫為DNA-pol模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質因子第27頁/共111頁(一)復制的起始需要解決兩個問題:1.DNA解開成單鏈,提供模板。2.合成引物,提供3-OH末端。二、復制過程第28頁/共111頁DNA雙螺旋的解開:在大腸桿菌中,解鏈酶在復制叉內解開親代雙螺旋,分開的雙鏈再和SSB結合,防止鏈內退火重新復性成為雙鏈,使局部解開的兩條單鏈可以作為復制模板。不論線狀或環(huán)狀DNA分子,在細胞內均以超螺旋形式存在,而且局部解鏈會導致超螺旋應力的增加,會阻礙解鏈的前進。因此必須放出超螺旋應力。在大腸桿菌中是由拓撲異構酶II切開環(huán)狀超螺旋的兩股,釋放出超螺旋應力,而后再封口,除去環(huán)狀DNA分子中的超螺旋。第29頁/共111頁E.coli復制起始點oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復序列

反向重復序列53531.DNA解鏈第30頁/共111頁拓撲異構酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈,使DNA解鏈旋轉不致打結;適當時候封閉切口,DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應不需ATP。拓撲異構酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈,斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。利用ATP供能,連接斷端,DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。作用機制

第31頁/共111頁解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能,作用于氫鍵,使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——復制起始時催化生成RNA引物的酶單鏈DNA結合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整

第32頁/共111頁RNA引物的合成:目前已發(fā)現(xiàn)的全部DNA聚合酶都不能從頭合成DNA新鏈,只能延長已經存在的DNA鏈。因此,在合成DNA鏈之前必須有一種引物。所謂引物就是在DNA模板鏈上裝配的一小段互補RNA,而末端的一個核苷酸要有一個游離的3′-OH。DNA聚合酶只能把底物(dNTP)轉移到引物游離的3′-OH上去。在大腸桿菌中合成RNA引物的酶是引物酶。它在合成RNA引物之前,還需要與dnaB蛋白的結合。

第33頁/共111頁DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異構酶引物酶SSB35352.引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。

第34頁/共111頁一、復制的化學反應

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

第35頁/共111頁5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′35外切酶活性

53外切酶活性?能切除突變的DNA片段。能辨認錯配的堿基對,并將其水解。

核酸外切酶活性

第36頁/共111頁DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀A:DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基;并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B:堿基配對正確,DNA-pol不表現(xiàn)活性。第37頁/共111頁3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶第38頁/共111頁(二)復制的延長復制的延長指在DNA-pol催化下,dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上,其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。

第39頁/共111頁5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol第40頁/共111頁DNA鏈的延伸:DNA聚合酶催化5′→3′方向合成。岡崎于1968年提出了半不連續(xù)復制假說。前導鏈(領頭連)(leadingstrand)

滯后鏈(隨從連)(laggingstrand)

岡崎片段(Okazakifragment)

大腸桿菌岡崎片段為1000個核苷酸,哺乳動物中約為100~200個核苷酸。第41頁/共111頁領頭鏈的合成第42頁/共111頁隨從鏈的合成第43頁/共111頁第44頁/共111頁復制過程簡圖第45頁/共111頁原核生物基因是環(huán)狀DNA,雙向復制的復制片段在復制的終止點(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500(三)復制的終止第46頁/共111頁RNA引物的切除:在大腸桿菌中由DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切活性完成的,留下的空隙由該酶的5′→3′聚合活性填補。岡崎片段的連接:填補后的岡崎片段由DNA連接酶封閉缺口,把小片段連接成完整的子代鏈。由于大腸桿菌的染色體是環(huán)狀的,其5′最末端岡崎片段的RNA引物被切除后可借助于另半圈的DNA鏈向前延伸來填補,最后可在DNA連接酶的作用下首尾相連,形成完整的基因組基因。大腸桿菌DNA在一個復制叉內的合成過程見圖。而對于真核生物來說,其染色體基因組是雙鏈線狀,在復制后,不能像原核生物那樣填補5′末端的空缺,從而會使5′末端序列因此而縮短,真核生物通過形成端粒結構來解決這個問題。第47頁/共111頁E.coli第48頁/共111頁555DNA-polIOHP5DNA-polⅠdNTP55PATP

ADP+Pi55DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接第49頁/共111頁第50頁/共111頁連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端,使二者生成磷酸二酯鍵,從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式第51頁/共111頁HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’第52頁/共111頁DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能第53頁/共111頁三、DNA復制的半保留性

早在1953年,J.Watson和F.Crick提出DNA雙螺旋模型的同時,就已經提出了DNA的復制是半保留復制(semiconservativereplication),即在復制開始時親代DNA雙股鏈間的氫鍵斷裂,雙鏈分開,然后以每一條鏈為模板,分別復制出與其互補的子代鏈,從而使一個DNA分子轉變成與之完全相同的兩個DNA分子。按照這種方式復制出來的每個子代雙鏈DNA分子中,都含有一條來自親代的舊鏈和一條新合成的DNA鏈,所以把這種復制方式稱為半保留復制。半保留復制是雙鏈DNA分子普遍的復制方式。第54頁/共111頁第55頁/共111頁DNA的半保留復制有重要的生物學意義因為復制必須準確無誤,否則將危及生物的生存。通過長期的進化過程,生物獲得了確保復制準確性的機能,即利用半保留復制方式將自身DNA中蘊涵的全部遺傳信息傳給后代,例如大腸桿菌復制DNA時,109至1010個堿基對才可能發(fā)生一個誤差。第56頁/共111頁如何保證復制的準確性:①DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的5′→3′的聚合作用:DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ在模板引導下,按5′→3′進行DNA聚合時,可以嚴格按照堿基互補配對的原則進行合成,所以說,堿基互補配對原則是DNA復制的基礎。②DNA聚合酶Ⅰ3′→5′外切酶活性

:DNA聚合酶Ⅰ可對已經加上去的核苷酸進行校對,當新合成的互補鏈上有錯誤的核苷酸時,即行使3′→5′外切酶活性,將連接上的錯誤核苷酸從3′端切除,直至正確配對為止,然后再繼續(xù)合成。③切除引物:

由于剛開始聚合時較易發(fā)生錯配,所以生命體選擇先合成一段RNA引物,然后由DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切酶活性將引物切除,再由DNA聚合酶的5′→3′聚合酶活性在切除引物處補平。第57頁/共111頁④聚合時的方向:

已知DNA的聚合都是5′→3′,為什么不能從3′→5′聚合呢?原因是,如果按5′→3′聚合,一旦出現(xiàn)堿基錯配,可由DNA聚合酶Ⅰ從3′端切除聚合上的錯誤核苷酸,剩下3′-羥基,dNTP可以和游離3′-羥基生成3′,5′-磷酸二酯鍵,dNTP自身水解掉焦磷酸。發(fā)生反應的原料本身即為高能化合物,靠磷酸鍵的水解即可保證此反應的順利進行。而如果按3′→5′方向聚合時,出現(xiàn)了錯配堿基后也可利用DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切酶活性將錯配的核苷酸切除,切除后剩下5′-羥基或5′-磷酸,繼續(xù)聚合時,需要將5′-羥基或5′-磷酸核苷酸進一步磷酸化,或者需要外源能夠提供能量的物質,才能完成聚合反應。所以,生物體選擇DNA合成的方向都是5′→3′,這是長期進化、選擇的結果。⑤修復作用:雖然在復制過程中有校正功能,但是環(huán)境中的物理或化學因素還可以使DNA不斷受到損傷,它們可以通過細胞的各種修復機制進行修復,具體內容見DNA的損傷與修復。第58頁/共111頁哺乳動物的細胞周期DNA合成期G1G2SM第三節(jié)真核生物DNA的復制

?細胞能否分裂,決定于進入S期及M期這兩個關鍵點。G1→S及G2→M的調節(jié),與蛋白激酶活性有關。?蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調控作用。第59頁/共111頁?真核生物每個染色體有多個起始點,是多復制子復制。復制有時序性,即復制子以分組方式激活而不是同步起動。

?復制的起始需要DNA-polα(引物酶活性)和polδ(解螺旋酶活性)參與。還需拓撲異構酶和復制因子(replicationfactor,RF)。?增殖細胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在復制起始和延長中起關鍵作用。一、復制的起始第60頁/共111頁3553領頭鏈3535親代DNA隨從鏈引物核小體二、復制的延長第61頁/共111頁染色體DNA呈線狀,復制在末端停止。復制中岡崎片段的連接,復制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復制的RNA引物,去除后留下空隙。三、復制的終止第62頁/共111頁53355335+5333355目錄第63頁/共111頁端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端的結構。功能?維持染色體的穩(wěn)定性?維持DNA復制的完整性結構特點?由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成。?末端DNA序列是多次重復的富含TG堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…第64頁/共111頁端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成:第65頁/共111頁端粒酶的催化延長作用爬行模型目錄第66頁/共111頁DNA聚合酶復制子鏈進一步加工目錄第67頁/共111頁TTGGGGTTGGGGTTGGGG5’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC

3’5‘OH3’5’CCAACCCC3’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC2.聚合

1.結合3.移位

爬行模式端粒酶的功能TTGGGGTTGGGGCCAACCCC染色體DNA端粒第68頁/共111頁末端補齊機制:5’GGGGTT(GGGGTT)n端粒酶5’G-G配對回折3’5’DNA聚合酶第69頁/共111頁逆轉錄和其他復制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四節(jié)第70頁/共111頁逆轉錄酶(reversetranscriptase)

逆轉錄(reversetranscription)

RNADNA

逆轉錄酶一、逆轉錄病毒和逆轉錄酶

第71頁/共111頁逆轉錄酶(reversetranscriptase)是1970年在致癌RNA病毒(鳥類成髓細胞白血病病毒和勞氏肉瘤病毒)中首次發(fā)現(xiàn)的,后來發(fā)現(xiàn)該酶存在于某些RNA病毒和個別DNA病毒中。病毒逆轉錄酶催化RNA指導下的DNA合成,即以病毒RNA為模板,以dNTP為底物,催化合成一條與模板RNA互補的DNA鏈,此DNA鏈稱為互補DNA鏈(complementaryDNA,cDNA)。反應方式與其它DNA聚合酶相同,也是5′→3′合成,并需要RNA作引物。當致癌病毒的RNA進入宿主細胞后,首先在逆轉錄酶的催化下,按上述方式合成一條cDNA鏈,形成RNA-DNA雜交分子。逆轉錄酶中有RNase活性的組分水解雜交鏈中的RNA,被感染細胞內的RNaseH也可水解RNA鏈。然后,再由DNA聚合酶I一邊切除RNA,一邊以第一鏈cDNA為模板,催化合成與之互補的另一條DNA鏈,形成雙鏈DNA分子。第72頁/共111頁逆轉錄酶有三種酶活性,①RNA指導的DNA合成反應;②RNA的水解反應;③DNA指導的DNA合成反應。第73頁/共111頁逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現(xiàn)象RNA模板逆轉錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉錄酶雙鏈DNA第74頁/共111頁逆轉錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學研究可應用逆轉錄酶,作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一,此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板,經逆轉錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。試管內合成cDNAcDNAcomplementaryDNA第75頁/共111頁二、逆轉錄研究的意義

逆轉錄酶和逆轉錄現(xiàn)象,是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

逆轉錄現(xiàn)象說明:至少在某些生物,RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。對逆轉錄病毒的研究,拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。

第76頁/共111頁

滾環(huán)復制(rollingcirclereplication)三、滾環(huán)復制和D環(huán)復制

是某些低等生物的復制形式,如X174和M13噬菌體等。第77頁/共111頁3-OH5-P55533335'滾環(huán)復制5'5335目錄第78頁/共111頁dNTPDNA-polγ

D環(huán)復制(D-loopreplication)

是線粒體DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)的復制形式。

第79頁/共111頁DNA損傷(突變)與修復DNADamage(Mutation)andRepair第五節(jié)第80頁/共111頁遺傳物質的結構改變而引起的遺傳信息改變,均可稱為突變。在復制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水平來看,突變就是DNA分子上堿基的改變。

第81頁/共111頁

造成DNA損傷的原因可能是生物因素、物理因素或化學因素,DNA的重組,病毒的整合,某些物理化學因子,如紫外線、電離輻射和化學誘變劑都會造成DNA局部結構和功能的破壞,受到破壞的可能是DNA的堿基、核糖或是磷酸二酯鍵,DNA在復制過程中也仍然可能產生錯配。造成DNA損傷的因素可能來自細胞內部,也可能來自細胞外部,損傷的結果是引起生物突變,甚至導致死亡。保證DNA分子的完整性對于生物是至關重要的。在長期的進化過程中,生物體獲得了復雜的DNA損傷修復系統(tǒng),可以通過不同的途徑對DNA的損傷進行修復。這些途徑可分成兩大類:第82頁/共111頁光誘導的修復(光復活)不依賴于光的修復(暗修復)切除修復重組修復應急修復第83頁/共111頁一、突變的意義(一)突變是進化、分化的分子基礎(二)突變導致基因型改變和基因多態(tài)性的形成(三)突變導致死亡(四)突變是某些疾病的發(fā)病基礎

第84頁/共111頁第85頁/共111頁經典遺傳學突變

紅花白花高植株矮植株

孟德爾第86頁/共111頁德弗里斯:孟德爾學說的重新發(fā)現(xiàn)者。9株典型植株自花授粉種植了七代典型植株大多數變異類型少數(巨型、矮型等)自花授粉變異傳給后代第87頁/共111頁二、引發(fā)突變的因素物理因素

紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV第88頁/共111頁化學因素目錄(5-溴尿嘧啶)第89頁/共111頁三、突變的分子改變類型錯配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

第90頁/共111頁DNA分子上的堿基錯配稱點突變(pointmutation)。發(fā)生在同型堿基之間,即嘌呤代替另一嘌呤,或嘧啶代替另一嘧啶。

1.轉換發(fā)生在異型堿基之間,即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。

2.顛換(一)錯配第91頁/共111頁鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

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C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

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C肽鏈CTCGAG基因第92頁/共111頁

1949年波林發(fā)現(xiàn)鐮刀型細胞貧血癥(病人的紅血細胞為鐮刀形)與血紅蛋白結構異常相關。

第93頁/共111頁(二)缺失、插入和框移缺失:一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入:原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間??蛞仆蛔兪侵溉?lián)體密碼的閱讀方式改變,造成蛋白質氨基酸排列順序發(fā)生改變。

缺失或插入都可導致框移突變

。第94頁/共111頁谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變第95頁/共111頁(三)重排DNA分子內較大片段的交換,稱為重組或重排。

第96頁/共111頁由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型目錄第97頁/共111頁四、DNA損傷的修復修復(repairing)是對已發(fā)生分子改變的補償措施,使其回復為原有的天然狀態(tài)。光修復(lightrepairing)切除修復(excisionrepairing)重組修復(recombinationrepairing)SOS修復

修復的主要類型第98頁/共111頁

紫外光照射可以使DNA分子中同一條鏈的兩相鄰胸腺嘧啶之間形成二聚體(TT)。(一)光修復第99頁/共111頁

嘧啶二聚體的形成,影響了DNA的雙螺旋結構,使其復制和轉錄功能均受到阻礙。光復活作用的機制是可見光(最有效波長為400nm左右)激活了光復活酶(photo-reactivatingenzyme),它能分解由于紫外線照射而形成的嘧啶二聚體。光復活作用是一種高度專一的直接修復方式,它只作用于紫外線引起的DNA嘧啶二聚體。光復活酶在生物界分布很廣,幾乎在所有的生物細胞中都已發(fā)現(xiàn)。這種修復方式在植物中特別重要。對于人和高等動物來說更重要的是暗修復,即切除含嘧啶二聚體的核苷酸鏈,然后再修復合成。第100頁/共111頁光修復酶(photolyase)

UV第101頁/共111頁

所謂切除修復即在一系列酶的作用下,將DNA分子中受到損傷的部分切除掉,并以完整的那一條鏈為模板,合成切去的部分,然后使DNA恢復正常結構的過程。①由特異的核酸內切酶在損傷位置將DNA單鏈切斷。②由5′-核酸外切酶將損傷片段切除。③以另一條完整的鏈為模板,由DNA聚合酶在缺口處進行修復合成。④最后由連接酶將新合成的DNA鏈與原來的鏈連接在一起。

(二)切除修復第102頁/共111頁

在大腸桿菌中DNA聚合酶Ⅰ兼有5′→3′聚合和5′→3′外切酶活性,在切除與修復合成兩步中可由一個酶來完成。在真核細胞中DNA聚合酶沒有外切酶活性,切除必須由另外的酶來完成,如有許多種特異的DNA糖苷酶(glycosylase),它們能夠識別DNA中不正常的堿基,并將其水解下來,形成無嘌呤或無嘧啶位點,稱為AP

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