生物合成 的學習材料

生物合成的學習材料第1頁/共111頁DNA復制的概念：以DNA為模板，以4種dNTP為原料，在DNA聚合酶的作用下合成與模板互補的DNA分子的過程。

DNA復制是在細胞分裂前進行的。DNA通過自我復制生成2個與原來分子完全相同的DNA分子，細胞分裂后分別進入兩個子細胞中，這樣就把遺傳信息由親代DNA分子傳給子代DNA分子。第2頁/共111頁第3頁/共111頁n1dATPn1dTTPn2dGTPn2dCTP+++++DNA2DNAdAMPdTMPdGMPdCMP2(n1+n2)PPiDNA聚合酶、DNA連接酶、引物酶、解旋酶、單鏈結合蛋白等。第4頁/共111頁DNA復制方式：半保留復制(semiconservativereplication)。DNA在復制時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈是新合成的，這種復制方式為半保留復制。

第5頁/共111頁DNAReplicationissemiconservative

EachDNAstrandservesastemplateforthesynthesisofanewstrand,producingtwonewDNAmolecules,eachwithonenewstrandandoneoldstrand.ThisissemiconservativereplicationMeselsonandStahl(In1957)第6頁/共111頁

第一節(jié)

參與DNA復制的主要酶類與蛋白因子（DNA復制系統(tǒng)）一、原核生物

拓撲異構酶（topoisomerase）是一類可改變DNA拓撲性質的酶。在DNA復制時，復制叉行進的前方DNA分子部分產生正超螺旋，拓撲異構酶可松弛正超螺旋，還可以引入負超螺旋，有利于復制叉的行進及DNA的合成。在復制完成后，拓撲異構酶又向DNA分子引入負超螺旋，有利于DNA纏繞、折疊、壓縮以形成染色質。DNA拓撲異構酶主要有Ⅰ和Ⅱ兩種類型:

拓撲異構酶I:

它可使DNA的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應無需供給能量。另外，DNA復制時負超螺旋的消除，亦由拓撲異構酶Ⅰ來完成，但它對正超螺旋無作用；

第7頁/共111頁

拓撲異構酶Ⅱ：又稱為旋轉酶（gyrase），由兩個A亞基和兩個B亞基組成，即A2B2。它能使DNA的兩條鏈同時發(fā)生斷裂和再連接，當它引入負超螺旋以消除復制叉前進帶來的扭曲張力時，需要由ATP提供能量。兩種拓撲異構酶在DNA復制、轉錄和重組中均發(fā)揮重要作用。第8頁/共111頁

解旋酶（Helicase，DnaB）：也稱為解鏈酶。在復制叉處在其它因子的參與下利用水解ATP將DNA雙股鏈解開。其它因子主要包括：DnaA，識別大腸桿菌復制原點OriC，啟動解鏈過程；DnaC，幫助解鏈酶（DnaB）結合

每解開一對堿基，需要水解2分子ATP。解旋酶不只有一種，還有參與轉錄、DNA修復、DNA重組等過程的解旋酶。

第9頁/共111頁

單鏈DNA結合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSBprotein）：與解開的DNA單鏈結合，防止堿基對的重新結合。大腸桿菌的SSB蛋白由4個相同亞基構成，其功能在于穩(wěn)定解開的DNA單鏈，阻止DNA復性和保護單鏈部分不被核酸酶降解。原核生物的SSB蛋白與DNA的結合表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應：當第一個分子結合后，其他分子與DNA的結合能力可提高103倍。因此一旦結合反應開始，即迅速擴展，直至全部單鏈DNA都被SSB蛋白覆蓋。SSB蛋白可以重復利用

第10頁/共111頁解旋酶拓撲異構酶第11頁/共111頁

引物酶（primase，DnaG）：又稱引發(fā)酶，一種特殊的RNA聚合酶，用于合成RNA引物。已知DNA聚合酶催化DNA片段的合成要求一段與模板互補、帶有3-OH的DNA或RNA片段作引物。Ecoli是由dnaG基因編碼。該酶分子量約為60000，該酶單獨存在時相當不活潑，只有與其他蛋白質相互作用結合成一個復合體時才有活性，這種復合體稱為引發(fā)體（primosome）。合成的引物是長約5~10個核苷酸的RNA。一旦RNA引物合成，就可以由DNA聚合酶Ⅲ在它的3′-OH上繼續(xù)催化DNA新鏈的合成。

第12頁/共111頁DNA聚合酶（DNApolymerase）是以DNA為模板，催化底物（dNTP）合成DNA的酶類，普遍存在于生物體內。它們的作用方式基本相同，都需要dNTP、Mg2+、模板DNA和引物，在DNA模板指導下，催化底物加到引物的3′-OH上，形成3′,5′磷酸二酯鍵，由5′→3′方向延長DNA鏈，見下圖。引物是DNA合成所必需的。第13頁/共111頁大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ由一條分子量為101000的單一多肽鏈組成，多肽鏈中含有一個鋅原子。每個大腸桿菌細胞約有400個分子的DNA聚合酶Ⅰ。DNA聚合酶Ⅰ的功能如下：①5’→3’聚合酶活性，即當底物和模板存在時，DNA聚合酶Ⅰ可使脫氧核糖核苷酸逐個加到引物的3′-OH末端的多核苷酸鏈上，在37℃條件下，每分子DNA聚合酶Ⅰ每分鐘可以催化大約1000個脫氧核苷酸的聚合；②5’→3’外切酶活性，它可以及時切除復制起始合成的RNA引物；③3’→5’外切酶活性，起校對功能，它可以切除聚合上去的錯誤核苷酸，從而可使復制的忠實性提高1000倍。DNA聚合酶Ⅰ可以被蛋白酶切成2個片段，大片段（68000）稱為Klenow，具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，是分子生物學研究中常用的工具酶。小片段(35000)具有5′→3′外切酶活性，可以切除少量的核苷酸。第14頁/共111頁

DNA聚合酶Ⅱ為多亞基酶，由分子量約為88000的多肽鏈組成，其活力比DNA聚合酶Ⅰ高，每分鐘可催化約2400個核苷酸的聚合。DNA聚合酶Ⅱ具有5′→3′聚合酶活性外，也有3′→5′核酸外切酶活性，但無5′→3′外切酶活性。它也只是修復酶，而非真正的復制酶。第15頁/共111頁

DNA聚合酶Ⅲ：被認為是真正的DNA復制酶(replicase)，全酶由α、β、γ、ε、θ、τ、ψ、χ、δ、δ`等10種亞基組成，也含有鋅原子，分子量大約900000，以二聚體起作用。α亞基主要有5′→3′聚合活性，ε亞基具有3′→5′核酸外切酶活性，2個β亞基充當“滑動夾子”，它通過γ復合物夾子載體組裝到DNA上，此步驟需要ATP。2個β亞基圍繞雙螺旋形成一個環(huán)，以利于聚合酶沿著模板滑動。正是由于DNA聚合酶Ⅲ的組成復雜，使它具有了強催化活性、忠實性、持續(xù)性。DNA聚合酶Ⅲ可連續(xù)催化幾千個磷酸二酯鍵的形成。所以它催化的合成速度達到了體內DNA合成的速度。它還有3′→5′核酸外切酶活性，使得復制的忠實性由7×10-6提高至5×10-9，但DNA聚合酶Ⅲ無5′→3′外切活性。第16頁/共111頁表

13?1大腸桿菌三種DNA聚合酶的性質比較DNA

聚合酶Ecoli：DNApolymeraseI,II,III,IV,VDNApolyI：具有5’→3’聚合、5’→3’外切、3’→5’外切活性,主要參與DNA修復，切除引物；DNApolyII：與DNApolyI功能相似；但沒有5’→3’外切酶活性DNApolyIII：DNA合成。具有5’→3’聚合、3’→5’外切活性,沒有5’→3’外切酶活性DNApolyIVandV:1999發(fā)現(xiàn)，涉及DNA錯誤傾向修復。真核生物：DNApolymeraseα,β,γ,δ,ε1.DNApolyα:DNA合成

2.DNApolyβ:DNA修復

3.DNApolyγ:線粒體DNA合成

4.DNApolyδ:

DNA合成

4.DNApolyε

:DNA修復第17頁/共111頁DNA連接酶（DNAligase）:大腸桿菌DNA連接酶是一條分子量約為74000的多肽，每個大腸桿菌細胞含有約300個連接酶分子。它催化雙鏈DNA切口處的5′-磷酸基和3′-羥基生成磷酸二酯鍵，反應需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）提供能量，并釋放出煙酰胺單核苷酸（NMN）。在真核生物中DNA連接酶則需要ATP。DNA連接酶在DNA的復制、修復和重組等過程中均起重要作用。第18頁/共111頁二、真核生物拓撲異構酶Ⅰ（topoisomerase）：真核生物的是分子量約為95000的單體蛋白。雖然它所催化的反應與原核生物的酶相似，但它同樣能使正、負超螺旋DNA松弛。松弛作用不依賴于ATP，能發(fā)生于有EDTA存在的條件下，Mg2+能提高該酶的活力。拓撲異構酶Ⅱ為150000~180000的均二聚體，能以同樣的速率松弛正、負超螺旋DNA；與原核生物不同的是，真核生物拓撲異構酶Ⅱ不能產生負超螺旋，發(fā)揮作用時需要ATP和Mg2+。

第19頁/共111頁DNA聚合酶（DNApolymerase）真核生物有多種。哺乳動物有5種DNA聚合酶：

DNApolymeraseα、

DNApolymeraseβ、

DNApolymeraseγ、

DNApolymeraseδ、

DNApolymeraseε

它們與大腸桿菌DNA聚合酶的基本性質相同，都是以4種脫氧核糖核苷三磷酸為底物，需Mg2+激活，聚合時必須有模板和3′-OH的存在，鏈的延伸方向為5′→3′。第20頁/共111頁細胞核染色體的復制由DNA聚合酶α和δ共同完成。DNA聚合酶α為多亞基酶，其中一個亞基具有引物合成酶活性，最大的亞基具有聚合酶活性，無外切酶活性的亞基。DNA聚合酶δ既有持續(xù)合成DNA鏈的能力，又有校正功能，由它完成DNA的復制。DNA聚合酶ε可能相當于細菌的DNA聚合酶Ⅰ，它是一種修復酶，參與DNA的修復合成，并存在于復制叉處，用以取代滯后鏈岡崎片段的引物。DNA聚合酶β也是修復酶。DNA聚合酶γ是線粒體DNA的合成酶。第21頁/共111頁復制蛋白A（replicationproteinA，RP-A）是真核生物的單鏈DNA結合蛋白，其作用類似于大腸桿菌的SSB蛋白。

復制因子C（replicationfactorC，RF-C）是夾子裝置，相當于大腸桿菌的γ復合物，它控制滯后鏈上酶的結合與脫離。第22頁/共111頁

端粒（telomere）是真核生物線性染色體末端的特殊結構，它由成百個6個核苷酸的重復序列所組成（人的是TTAGGG，四膜蟲為TTGGGG）。端粒的功能是穩(wěn)定染色體的末端結構，防止染色體間末端連接，并可補償滯后鏈5′-末端在消除RNA引物后造成的空缺。復制可使端粒5′末端縮短，而端粒酶（telomerase）可外加重復單位到5′-末端上，結果使端粒維持一定的長度。

真核生物的端粒酶是一種含有RNA鏈的逆轉錄酶，它以自身所含的RNA為模板來合成DNA的端粒結構。通常端粒酶是含約150個核苷酸的RNA鏈，其中含1.5個拷貝的端粒重復單位的模板。端粒酶可結合到端粒的3′末端上，每次都是RNA模板的5′末端堿基（CCCCAACCCCAA）識別DNA的3′末端堿基（TTGGGGTTGGGG）并相互配對，以RNA鏈為模板使DNA鏈延伸，合成一個重復單位后酶再向前移動一個單位。端粒的3′單鏈末端可回折作為引物，合成其互補鏈。

第23頁/共111頁第24頁/共111頁第二節(jié)DNA的復制過程一、DNA復制的起始點和方向

復制原點（originofreplication，Ori），復制叉（replicationfork）或稱為生長點（growingpoint）復制眼（replicationeye）由于大腸桿菌的DNA是雙鏈環(huán)狀，在鏡下可觀察到θ形結構。大腸桿菌只有一個復制原點。

真核生物的一條染色體DNA中，有多個復制原點。

第25頁/共111頁5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復制子3’第26頁/共111頁參與DNA復制的物質

底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質因子第27頁/共111頁（一）復制的起始需要解決兩個問題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。二、復制過程第28頁/共111頁DNA雙螺旋的解開：在大腸桿菌中，解鏈酶在復制叉內解開親代雙螺旋，分開的雙鏈再和SSB結合，防止鏈內退火重新復性成為雙鏈，使局部解開的兩條單鏈可以作為復制模板。不論線狀或環(huán)狀DNA分子，在細胞內均以超螺旋形式存在，而且局部解鏈會導致超螺旋應力的增加，會阻礙解鏈的前進。因此必須放出超螺旋應力。在大腸桿菌中是由拓撲異構酶II切開環(huán)狀超螺旋的兩股，釋放出超螺旋應力，而后再封口，除去環(huán)狀DNA分子中的超螺旋。第29頁/共111頁E.coli復制起始點oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復序列

反向重復序列53531.DNA解鏈第30頁/共111頁拓撲異構酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結；適當時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應不需ATP。拓撲異構酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。作用機制

第31頁/共111頁解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——復制起始時催化生成RNA引物的酶單鏈DNA結合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整

第32頁/共111頁RNA引物的合成：目前已發(fā)現(xiàn)的全部DNA聚合酶都不能從頭合成DNA新鏈，只能延長已經存在的DNA鏈。因此，在合成DNA鏈之前必須有一種引物。所謂引物就是在DNA模板鏈上裝配的一小段互補RNA，而末端的一個核苷酸要有一個游離的3′-OH。DNA聚合酶只能把底物（dNTP）轉移到引物游離的3′-OH上去。在大腸桿菌中合成RNA引物的酶是引物酶。它在合成RNA引物之前，還需要與dnaB蛋白的結合。

第33頁/共111頁DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異構酶引物酶SSB35352.引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。

第34頁/共111頁一、復制的化學反應

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

第35頁/共111頁5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′35外切酶活性

53外切酶活性?能切除突變的DNA片段。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。

核酸外切酶活性

第36頁/共111頁DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。第37頁/共111頁3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶第38頁/共111頁（二）復制的延長復制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。

第39頁/共111頁5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol第40頁/共111頁DNA鏈的延伸：DNA聚合酶催化5′→3′方向合成。岡崎于1968年提出了半不連續(xù)復制假說。前導鏈（領頭連）（leadingstrand）

滯后鏈（隨從連）(laggingstrand)

岡崎片段（Okazakifragment）

大腸桿菌岡崎片段為1000個核苷酸，哺乳動物中約為100~200個核苷酸。第41頁/共111頁領頭鏈的合成第42頁/共111頁隨從鏈的合成第43頁/共111頁第44頁/共111頁復制過程簡圖第45頁/共111頁原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制的復制片段在復制的終止點(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）復制的終止第46頁/共111頁RNA引物的切除：在大腸桿菌中由DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切活性完成的，留下的空隙由該酶的5′→3′聚合活性填補。岡崎片段的連接：填補后的岡崎片段由DNA連接酶封閉缺口，把小片段連接成完整的子代鏈。由于大腸桿菌的染色體是環(huán)狀的，其5′最末端岡崎片段的RNA引物被切除后可借助于另半圈的DNA鏈向前延伸來填補，最后可在DNA連接酶的作用下首尾相連，形成完整的基因組基因。大腸桿菌DNA在一個復制叉內的合成過程見圖。而對于真核生物來說，其染色體基因組是雙鏈線狀，在復制后，不能像原核生物那樣填補5′末端的空缺，從而會使5′末端序列因此而縮短，真核生物通過形成端粒結構來解決這個問題。第47頁/共111頁E.coli第48頁/共111頁555DNA-polIOHP5DNA-polⅠdNTP55PATP

ADP+Pi55DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接第49頁/共111頁第50頁/共111頁連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式第51頁/共111頁HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’第52頁/共111頁DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能第53頁/共111頁三、DNA復制的半保留性

早在1953年，J.Watson和F.Crick提出DNA雙螺旋模型的同時，就已經提出了DNA的復制是半保留復制(semiconservativereplication)，即在復制開始時親代DNA雙股鏈間的氫鍵斷裂，雙鏈分開，然后以每一條鏈為模板，分別復制出與其互補的子代鏈，從而使一個DNA分子轉變成與之完全相同的兩個DNA分子。按照這種方式復制出來的每個子代雙鏈DNA分子中，都含有一條來自親代的舊鏈和一條新合成的DNA鏈，所以把這種復制方式稱為半保留復制。半保留復制是雙鏈DNA分子普遍的復制方式。第54頁/共111頁第55頁/共111頁DNA的半保留復制有重要的生物學意義因為復制必須準確無誤，否則將危及生物的生存。通過長期的進化過程，生物獲得了確保復制準確性的機能，即利用半保留復制方式將自身DNA中蘊涵的全部遺傳信息傳給后代，例如大腸桿菌復制DNA時，109至1010個堿基對才可能發(fā)生一個誤差。第56頁/共111頁如何保證復制的準確性：①DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的5′→3′的聚合作用:DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ在模板引導下，按5′→3′進行DNA聚合時，可以嚴格按照堿基互補配對的原則進行合成，所以說，堿基互補配對原則是DNA復制的基礎。②DNA聚合酶Ⅰ3′→5′外切酶活性

:DNA聚合酶Ⅰ可對已經加上去的核苷酸進行校對，當新合成的互補鏈上有錯誤的核苷酸時，即行使3′→5′外切酶活性，將連接上的錯誤核苷酸從3′端切除，直至正確配對為止，然后再繼續(xù)合成。③切除引物:

由于剛開始聚合時較易發(fā)生錯配，所以生命體選擇先合成一段RNA引物，然后由DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切酶活性將引物切除，再由DNA聚合酶的5′→3′聚合酶活性在切除引物處補平。第57頁/共111頁④聚合時的方向:

已知DNA的聚合都是5′→3′，為什么不能從3′→5′聚合呢？原因是，如果按5′→3′聚合，一旦出現(xiàn)堿基錯配，可由DNA聚合酶Ⅰ從3′端切除聚合上的錯誤核苷酸，剩下3′-羥基，dNTP可以和游離3′-羥基生成3′,5′-磷酸二酯鍵，dNTP自身水解掉焦磷酸。發(fā)生反應的原料本身即為高能化合物，靠磷酸鍵的水解即可保證此反應的順利進行。而如果按3′→5′方向聚合時，出現(xiàn)了錯配堿基后也可利用DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切酶活性將錯配的核苷酸切除，切除后剩下5′-羥基或5′-磷酸，繼續(xù)聚合時，需要將5′-羥基或5′-磷酸核苷酸進一步磷酸化，或者需要外源能夠提供能量的物質，才能完成聚合反應。所以，生物體選擇DNA合成的方向都是5′→3′，這是長期進化、選擇的結果。⑤修復作用：雖然在復制過程中有校正功能，但是環(huán)境中的物理或化學因素還可以使DNA不斷受到損傷，它們可以通過細胞的各種修復機制進行修復，具體內容見DNA的損傷與修復。第58頁/共111頁哺乳動物的細胞周期DNA合成期G1G2SM第三節(jié)真核生物DNA的復制

?細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關鍵點。G1→S及G2→M的調節(jié)，與蛋白激酶活性有關。?蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調控作用。第59頁/共111頁?真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式激活而不是同步起動。

?復制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲異構酶和復制因子(replicationfactor,RF)。?增殖細胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在復制起始和延長中起關鍵作用。一、復制的起始第60頁/共111頁3553領頭鏈3535親代DNA隨從鏈引物核小體二、復制的延長第61頁/共111頁染色體DNA呈線狀，復制在末端停止。復制中岡崎片段的連接，復制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復制的RNA引物，去除后留下空隙。三、復制的終止第62頁/共111頁53355335+5333355目錄第63頁/共111頁端粒(telomere)指真核生物染色體線性DNA分子末端的結構。功能?維持染色體的穩(wěn)定性?維持DNA復制的完整性結構特點?由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成。?末端DNA序列是多次重復的富含TG堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…第64頁/共111頁端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成：第65頁/共111頁端粒酶的催化延長作用爬行模型目錄第66頁/共111頁DNA聚合酶復制子鏈進一步加工目錄第67頁/共111頁TTGGGGTTGGGGTTGGGG5’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC

3’5‘OH3’5’CCAACCCC3’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC2.聚合

1.結合3.移位

爬行模式端粒酶的功能TTGGGGTTGGGGCCAACCCC染色體DNA端粒第68頁/共111頁末端補齊機制：5’GGGGTT（GGGGTT）n端粒酶5’G-G配對回折3’5’DNA聚合酶第69頁/共111頁逆轉錄和其他復制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四節(jié)第70頁/共111頁逆轉錄酶(reversetranscriptase)

逆轉錄(reversetranscription)

RNADNA

逆轉錄酶一、逆轉錄病毒和逆轉錄酶

第71頁/共111頁逆轉錄酶（reversetranscriptase）是1970年在致癌RNA病毒(鳥類成髓細胞白血病病毒和勞氏肉瘤病毒)中首次發(fā)現(xiàn)的，后來發(fā)現(xiàn)該酶存在于某些RNA病毒和個別DNA病毒中。病毒逆轉錄酶催化RNA指導下的DNA合成，即以病毒RNA為模板，以dNTP為底物，催化合成一條與模板RNA互補的DNA鏈，此DNA鏈稱為互補DNA鏈（complementaryDNA，cDNA）。反應方式與其它DNA聚合酶相同，也是5′→3′合成，并需要RNA作引物。當致癌病毒的RNA進入宿主細胞后，首先在逆轉錄酶的催化下，按上述方式合成一條cDNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子。逆轉錄酶中有RNase活性的組分水解雜交鏈中的RNA，被感染細胞內的RNaseH也可水解RNA鏈。然后，再由DNA聚合酶I一邊切除RNA，一邊以第一鏈cDNA為模板，催化合成與之互補的另一條DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。第72頁/共111頁逆轉錄酶有三種酶活性，①RNA指導的DNA合成反應；②RNA的水解反應；③DNA指導的DNA合成反應。第73頁/共111頁逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現(xiàn)象RNA模板逆轉錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉錄酶雙鏈DNA第74頁/共111頁逆轉錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學研究可應用逆轉錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經逆轉錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。試管內合成cDNAcDNAcomplementaryDNA第75頁/共111頁二、逆轉錄研究的意義

逆轉錄酶和逆轉錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

逆轉錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。對逆轉錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。

第76頁/共111頁

滾環(huán)復制(rollingcirclereplication)三、滾環(huán)復制和D環(huán)復制

是某些低等生物的復制形式，如X174和M13噬菌體等。第77頁/共111頁3-OH5-P55533335'滾環(huán)復制5'5335目錄第78頁/共111頁dNTPDNA-polγ

D環(huán)復制(D-loopreplication)

是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復制形式。

第79頁/共111頁DNA損傷（突變）與修復DNADamage(Mutation)andRepair第五節(jié)第80頁/共111頁遺傳物質的結構改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。在復制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。

第81頁/共111頁

造成DNA損傷的原因可能是生物因素、物理因素或化學因素，DNA的重組，病毒的整合，某些物理化學因子，如紫外線、電離輻射和化學誘變劑都會造成DNA局部結構和功能的破壞，受到破壞的可能是DNA的堿基、核糖或是磷酸二酯鍵，DNA在復制過程中也仍然可能產生錯配。造成DNA損傷的因素可能來自細胞內部，也可能來自細胞外部，損傷的結果是引起生物突變，甚至導致死亡。保證DNA分子的完整性對于生物是至關重要的。在長期的進化過程中，生物體獲得了復雜的DNA損傷修復系統(tǒng)，可以通過不同的途徑對DNA的損傷進行修復。這些途徑可分成兩大類：第82頁/共111頁光誘導的修復（光復活）不依賴于光的修復（暗修復）切除修復重組修復應急修復第83頁/共111頁一、突變的意義（一）突變是進化、分化的分子基礎（二）突變導致基因型改變和基因多態(tài)性的形成（三）突變導致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎

第84頁/共111頁第85頁/共111頁經典遺傳學突變

紅花白花高植株矮植株

孟德爾第86頁/共111頁德弗里斯：孟德爾學說的重新發(fā)現(xiàn)者。9株典型植株自花授粉種植了七代典型植株大多數變異類型少數（巨型、矮型等）自花授粉變異傳給后代第87頁/共111頁二、引發(fā)突變的因素物理因素

紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV第88頁/共111頁化學因素目錄(5-溴尿嘧啶)第89頁/共111頁三、突變的分子改變類型錯配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

第90頁/共111頁DNA分子上的堿基錯配稱點突變(pointmutation)。發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。

1.轉換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。

2.顛換（一）錯配第91頁/共111頁鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

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C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

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C肽鏈CTCGAG基因第92頁/共111頁

1949年波林發(fā)現(xiàn)鐮刀型細胞貧血癥（病人的紅血細胞為鐮刀形）與血紅蛋白結構異常相關。

第93頁/共111頁（二）缺失、插入和框移缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間?？蛞仆蛔兪侵溉?lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質氨基酸排列順序發(fā)生改變。

缺失或插入都可導致框移突變

。第94頁/共111頁谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變第95頁/共111頁（三）重排DNA分子內較大片段的交換，稱為重組或重排。

第96頁/共111頁由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型目錄第97頁/共111頁四、DNA損傷的修復修復(repairing)是對已發(fā)生分子改變的補償措施，使其回復為原有的天然狀態(tài)。光修復(lightrepairing)切除修復(excisionrepairing)重組修復(recombinationrepairing)SOS修復

修復的主要類型第98頁/共111頁

紫外光照射可以使DNA分子中同一條鏈的兩相鄰胸腺嘧啶之間形成二聚體（TT）。（一）光修復第99頁/共111頁

嘧啶二聚體的形成，影響了DNA的雙螺旋結構，使其復制和轉錄功能均受到阻礙。光復活作用的機制是可見光（最有效波長為400nm左右）激活了光復活酶（photo-reactivatingenzyme），它能分解由于紫外線照射而形成的嘧啶二聚體。光復活作用是一種高度專一的直接修復方式，它只作用于紫外線引起的DNA嘧啶二聚體。光復活酶在生物界分布很廣，幾乎在所有的生物細胞中都已發(fā)現(xiàn)。這種修復方式在植物中特別重要。對于人和高等動物來說更重要的是暗修復，即切除含嘧啶二聚體的核苷酸鏈，然后再修復合成。第100頁/共111頁光修復酶(photolyase)

UV第101頁/共111頁

所謂切除修復即在一系列酶的作用下，將DNA分子中受到損傷的部分切除掉，并以完整的那一條鏈為模板，合成切去的部分，然后使DNA恢復正常結構的過程。①由特異的核酸內切酶在損傷位置將DNA單鏈切斷。②由5′-核酸外切酶將損傷片段切除。③以另一條完整的鏈為模板，由DNA聚合酶在缺口處進行修復合成。④最后由連接酶將新合成的DNA鏈與原來的鏈連接在一起。

（二）切除修復第102頁/共111頁

在大腸桿菌中DNA聚合酶Ⅰ兼有5′→3′聚合和5′→3′外切酶活性，在切除與修復合成兩步中可由一個酶來完成。在真核細胞中DNA聚合酶沒有外切酶活性，切除必須由另外的酶來完成，如有許多種特異的DNA糖苷酶（glycosylase），它們能夠識別DNA中不正常的堿基，并將其水解下來，形成無嘌呤或無嘧啶位點，稱為AP