生物樣品的預(yù)處理

生物樣品的預(yù)處理第1頁(yè)/共48頁(yè)生物樣品的預(yù)處理不同來(lái)源樣品分離的預(yù)處理植物組織提取物的制備動(dòng)物組織提取物的制備細(xì)菌中重組蛋白的提取制備細(xì)胞的破碎與分離常見(jiàn)的方法細(xì)胞破碎技術(shù)的發(fā)展方向第2頁(yè)/共48頁(yè)1不同來(lái)源樣品分離的預(yù)處理樣品來(lái)源：植物、動(dòng)物、微生物，例如：植物或動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液、微生物發(fā)酵液、動(dòng)物血液、乳液和動(dòng)植物組織提取液等。生物樣品中往往含有大量有機(jī)物、無(wú)機(jī)物及各種微量元素等，因此對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行初步富集和分離，對(duì)干擾組分進(jìn)行初步去除等工作都屬于預(yù)處理。第3頁(yè)/共48頁(yè)生物樣品特征：目標(biāo)產(chǎn)物濃度普遍較低，懸浮液大部分是“水”，組分復(fù)雜，是含有細(xì)胞、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)、糖類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)等多種物質(zhì)的混合物；分離過(guò)程很容易發(fā)生失活現(xiàn)象，pH、離子強(qiáng)度、溫度等變化常常造成產(chǎn)物的失活；性質(zhì)不穩(wěn)定，易隨時(shí)間變化，如受空氣氧化，微生物污染，蛋白水解作用等。第4頁(yè)/共48頁(yè)分離過(guò)程注意點(diǎn)迅速加工，縮短停留時(shí)間控制好操作溫度和pH減少和避免與空氣接觸受污染的機(jī)會(huì)總體設(shè)計(jì)好各組分的分離順序第5頁(yè)/共48頁(yè)不同來(lái)源樣品分離的預(yù)處理1.1植物組織中活性物質(zhì)的提取1.1.1酶的提取植物組織中所存在的酚類(lèi)化合物使植物中提取酶的過(guò)程變得復(fù)雜。植物組織被破壞時(shí)，酶和酚類(lèi)處混合接觸狀態(tài)，很易發(fā)生反應(yīng)。產(chǎn)物苯醌和單寧酸類(lèi)會(huì)繼續(xù)和酶蛋白反應(yīng),使目的酶失去活性。為此去除酚類(lèi)化合物或避免反應(yīng)是必須進(jìn)行的步驟。第6頁(yè)/共48頁(yè)酚類(lèi)化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合方式可逆結(jié)合酚類(lèi)化合物的兩個(gè)羥基與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵，例如肽鍵的CO端和NH端不可逆結(jié)合酚類(lèi)化合物的兩個(gè)相鄰羥基被氧化為鄰苯醌之后，通過(guò)共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)分子中的自由氨基以及巰基結(jié)合引起蛋白質(zhì)活性基團(tuán)集合，引起聚集、交叉結(jié)合和沉淀（酶促褐變作用）第7頁(yè)/共48頁(yè)預(yù)處理需要注意：溫度盡可能低提取液的量要保證“充分浸入”加入足量酚類(lèi)吸附劑加入足量氧化酶抑制劑攪拌轉(zhuǎn)速要恰當(dāng)pH要控制在合適范圍，一般5.5～7第8頁(yè)/共48頁(yè)酚類(lèi)吸附劑的種類(lèi)：天然和合成的聚合物清蛋白尼龍粉聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（PVP）通過(guò)-CO-N=與酚羥基形成氫鍵聚乙烯聚吡咯烷酮-不溶的（PVPP）聚乙烯和聚丙烯樹(shù)脂，如離子交換樹(shù)脂XAD-2、-4和-7聚苯乙烯的離子交換樹(shù)脂，包括陰離子交換樹(shù)脂（Bio-RadAG1-X8,AG2-X8和Dowex-1）和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（Dowex-50）表面疏水，易吸附帶疏水基團(tuán)的化合物第9頁(yè)/共48頁(yè)酚氧化酶抑制劑抗氧化劑：2-巰基乙醇，二硫蘇糖醇(DTT)，二硫赤蘚糖醇(DTE)，抗壞血酸鹽前三種既是多酚氧化酶的抑制者又是醌的清除劑抗壞血酸鹽能阻止醌重新還原成酚，在低濃度的醌存在下就很易被消耗，因此須在相對(duì)較高的濃度條件下使用（50mmol/L）第10頁(yè)/共48頁(yè)1.1.2RNA的提取從植物組織中提取RNA是進(jìn)行植物分子生物學(xué)方面研究的必要前提。Northern雜交分析、純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫(kù)、RT-PCR及差示分析等過(guò)程中需要高質(zhì)量的RNA能否有效地去除多糖、酚類(lèi)化合物、萜類(lèi)化合物RNase和干擾RNA提取的其它代謝產(chǎn)物是提取高質(zhì)量植物RNA成敗的關(guān)鍵。酚類(lèi)化合物與RNA不可逆結(jié)合導(dǎo)致RNA活性喪失、用苯酚或氯仿抽提時(shí)RNA丟失、形成不溶性復(fù)合物多糖會(huì)形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀萜類(lèi)化合物和RNase會(huì)造成RNA的化學(xué)降解和酶解第11頁(yè)/共48頁(yè)酚類(lèi)化合物的干擾及對(duì)策還原劑法2-巰基乙醇(ME)、二硫蘇糖醇（DTT）或Cys來(lái)防止酚類(lèi)物質(zhì)被氧化，硼氫化鈉（NaBH4）是可還原醌的還原劑螯合劑法PVP和PVPP中的-CO－N＝基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強(qiáng)Tris-硼酸法硼酸可與酚類(lèi)靠氫鍵形成復(fù)合物，抑制了酚類(lèi)物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合第12頁(yè)/共48頁(yè)牛血清白蛋白（BSA）法原花色素類(lèi)物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類(lèi)似于抗原－抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復(fù)合物，減小了原花色素類(lèi)物質(zhì)與RNA結(jié)合的機(jī)會(huì)丙酮法用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料,可有效從云杉、松樹(shù)、山毛櫸等富含酚類(lèi)化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA通過(guò)Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類(lèi)化合物去除。第13頁(yè)/共48頁(yè)多糖的干擾及對(duì)策植物組織往往富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，較難將它們分開(kāi)。含多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液，對(duì)RNA提取造成較大的干擾。對(duì)策：

SDS-鹽酸胍處理；高濃度Na+或K+離子下，苯酚、氯仿抽提；低濃度乙醇沉淀多糖；醋酸鉀沉淀多糖。第14頁(yè)/共48頁(yè)蛋白雜質(zhì)的影響及對(duì)策蛋白質(zhì)是污染RNA樣品的又一個(gè)重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦屬于蛋白質(zhì)，因而要獲得完整的、高質(zhì)量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質(zhì)。常規(guī)方法：冷凍條件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取緩沖液中含有蛋白質(zhì)變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等，這樣在勻漿時(shí)可以使蛋白質(zhì)變性，凝聚；利用蛋白酶K來(lái)降解蛋白雜質(zhì)，進(jìn)一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。第15頁(yè)/共48頁(yè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響及對(duì)策從植物組織中提取高質(zhì)量RNA的另一個(gè)難點(diǎn)是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物很容易與RNA結(jié)合并與RNA共同被抽提出來(lái)而阻礙具有生物活性的RNA的分離。由于不能確定次級(jí)代謝產(chǎn)物具體是什么物質(zhì)，目前沒(méi)有什么特殊的方法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題第16頁(yè)/共48頁(yè)1.1.3多糖的提取多糖廣泛存在于植物、微生物（細(xì)菌和真菌）和海藻中，來(lái)源很廣。我國(guó)是中藥的起源之地，而糖類(lèi)是中藥材中普遍存在的成分，在對(duì)各種中藥材的化學(xué)成分研究的過(guò)程中，人們都少不了對(duì)其中多糖的關(guān)注。動(dòng)植物中或微生物胞內(nèi)多糖的釋放步驟：⑴去除表面脂質(zhì)，常用醇或醚回流脫脂；⑵脫脂殘?jiān)萌芤禾崛?即冷水，熱水，0.1～1.0mol/LNaOH，1%醋酸或1%苯酚等)；⑶提取液除雜：對(duì)于無(wú)機(jī)鹽及低分子量的有機(jī)物質(zhì)可用透析法、離子交換樹(shù)脂或凝膠過(guò)濾法除去；對(duì)于大分子雜質(zhì)可用酶消化(如蛋白酶、木質(zhì)素酶)，乙醇或丙酮等溶劑沉淀法或金屬絡(luò)合物法。第17頁(yè)/共48頁(yè)蛋白雜質(zhì)的影響及對(duì)策多糖提取液中除去蛋白質(zhì)是一個(gè)很重要的步驟，常用的方法有Sevag法氯仿：戊醇（或正丁醇）：多糖水溶液=5：1：6較溫和三氟三氯乙烷法多糖水溶液：三氟三氯乙烷=1：1效率高、不易大量應(yīng)用三氯乙酸法多糖水溶液中滴加3%三氯乙酸較劇烈，不適合含呋喃糖殘基的多糖酶解法前三種方法不適合糖肽的分離三氯醋酸法和Sevag法的脫蛋白效果相近，并且蛋白酶法與Sevag法相結(jié)合除蛋白的效果較好。第18頁(yè)/共48頁(yè)1.2動(dòng)物組織預(yù)處理注意事項(xiàng)勻漿化前的預(yù)處理(冷凍)提取物緩沖液的選擇(中性)蛋白酶抑制劑的添加保護(hù)劑的添加(β-巰基乙醇、EDTA、輔酶等)提取液的澄清(高速離心、沉淀、吸附等)第19頁(yè)/共48頁(yè)1.3微生物物質(zhì)的提取制備各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵液特性不同，其預(yù)處理方法的選擇也有所不同。大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，也有少數(shù)產(chǎn)物存在于菌體中，或發(fā)酵液和菌體中都含有。對(duì)于胞外產(chǎn)物，經(jīng)預(yù)處理應(yīng)盡可能使目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相，然后經(jīng)固液分離除去固相；對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，則應(yīng)首先收集菌體或細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞破碎后，目的產(chǎn)物進(jìn)入液相，隨后再將細(xì)胞碎片分離。第20頁(yè)/共48頁(yè)大腸桿菌重組蛋白的提取制備多拷貝質(zhì)粒上強(qiáng)啟動(dòng)子過(guò)量表達(dá)重組蛋白質(zhì)使整個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)水平提高,但大多情形下會(huì)導(dǎo)致諸如包含體的不溶性蛋白聚集的形成重組菌E.coliM15(pQE32-AGN)外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)(A未誘導(dǎo)，B誘導(dǎo))第21頁(yè)/共48頁(yè)包含體包含體（inclusionbodies）是無(wú)定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。包含體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞。因此當(dāng)除去變性劑時(shí)，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過(guò)程稱(chēng)為蛋白質(zhì)的復(fù)性。包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。這些基因表達(dá)產(chǎn)物沒(méi)有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。所以，包含體的出現(xiàn)增加了生化工程師生物分離設(shè)計(jì)的難度第22頁(yè)/共48頁(yè)重組蛋白的提取步驟大腸桿菌的酶解采用溶菌酶或超聲破碎方法來(lái)破壁包含體的清洗用溶劑清洗包含體能進(jìn)一步除去雜蛋白從包含體中溶解重組蛋白（變性）選擇和優(yōu)化溶解液（一般為尿素和鹽酸胍），使包含體中重組蛋白溶解重組蛋白的復(fù)性稀釋法、透析法、層析法、分子伴侶等第23頁(yè)/共48頁(yè)2細(xì)胞的破碎與分離細(xì)胞的破碎：用一定方法（機(jī)械法、物理法、化學(xué)法、酶法等）打開(kāi)細(xì)胞壁或膜，使細(xì)胞內(nèi)含物有效地釋放出來(lái)。提取：目的物從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到外界溶液中。細(xì)胞提取劑提取液（液體目的物）沉淀洗滌提取物（固體目的物）破碎勻漿離心第24頁(yè)/共48頁(yè)2.1細(xì)胞的破碎方法2.1.1機(jī)械法原理：機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生剪切力的作用破細(xì)胞組織搗碎法適合：硬度較大的動(dòng)、植物組織第25頁(yè)/共48頁(yè)高速勻漿法特點(diǎn)破碎程度高，而其機(jī)械剪切力對(duì)生物大分子的破壞較少，處理量大。原理利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針性閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破裂。適用較柔軟、易分散的組織細(xì)胞第26頁(yè)/共48頁(yè)高速勻漿機(jī)高速勻漿法為大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法，設(shè)備由高壓泵和勻漿閥組成。第27頁(yè)/共48頁(yè)研磨法與珠磨法研磨法(實(shí)驗(yàn)室規(guī)模)由陶瓷的研缽和研桿組成，加入少量研磨劑（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土）珠磨法(工業(yè)規(guī)模)進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英沙、氧化鋁等研磨劑（直徑<1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎,釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。適用：微生物（細(xì)菌）與植物細(xì)胞第28頁(yè)/共48頁(yè)珠磨機(jī)臥式珠磨機(jī)立式珠磨機(jī)第29頁(yè)/共48頁(yè)擠壓法微生物細(xì)胞在高壓下通過(guò)一個(gè)狹窄的孔道高速?zèng)_出，因突然減壓而引起一種空穴效應(yīng)，使細(xì)胞破碎。適用：細(xì)菌（革蘭氏陰性菌）第30頁(yè)/共48頁(yè)2.1.2物理法超聲波破碎頻率為20kHz以上的波，超過(guò)人耳可聽(tīng)范圍。其對(duì)細(xì)胞的破碎與空穴的形成有關(guān)?？昭ㄗ饔茫涸诔暡ㄗ饔孟?，使氣泡形成、脹大和破碎的現(xiàn)象。一般樣品濃度、聲強(qiáng)、頻率、介質(zhì)的離子強(qiáng)度、pH、處理時(shí)間都對(duì)破碎有影響。微生物細(xì)胞條件:樣品濃度50～100mg/ml，輸出功率100～200W，破碎時(shí)間3～5分鐘，間歇操作，樣品量≤40ml，冰浴操作第31頁(yè)/共48頁(yè)超聲破碎儀第32頁(yè)/共48頁(yè)滲透壓沖擊法高滲突然低滲，反復(fù)后可造成細(xì)胞破碎，促使內(nèi)含物釋放。適用：處理胞壁較脆弱的微生物。反復(fù)凍融法將材料深冷（-15℃～-20℃），形成水晶，破壞胞膜疏水鍵，增加親水性，反復(fù)可破細(xì)胞。適用：動(dòng)物材料第33頁(yè)/共48頁(yè)急熱驟冷法將材料投入沸水，維持85～90℃數(shù)分鐘，冰浴中急速冷卻，使胞壁結(jié)構(gòu)破壞。適用：細(xì)菌及病毒等中對(duì)熱不太敏感的物質(zhì)提取干燥法第34頁(yè)/共48頁(yè)2.1.3化學(xué)法溶劑處理法丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶劑可溶解胞膜上脂質(zhì)化合物，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。表面活性劑法添加如十二烷基磺酸鈉、去氧膽酸鈉等，通過(guò)破壞細(xì)胞膜而破碎細(xì)胞，釋放目的物。此法常需與其它方法結(jié)合應(yīng)用第35頁(yè)/共48頁(yè)2.1.4酶解法自溶法將欲破碎細(xì)胞在一定條件（pH、T）下保溫一定時(shí)間，通過(guò)細(xì)胞本身存在的酶系的作用，將細(xì)胞破壞，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放。外加酶法利用各種水解酶專(zhuān)一性地將細(xì)胞壁分解，使內(nèi)含物釋放出來(lái)。細(xì)菌：加溶菌酶（結(jié)合反復(fù)凍融或加EDTA）酵母：采用β-葡聚糖酶霉菌：添加幾丁質(zhì)酶植物材料：加纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等。第36頁(yè)/共48頁(yè)2.2選擇依據(jù)總原則：最大提取、不易變性、減少干擾具體須從材料特性、目的物特性綜合考慮材料細(xì)胞的特性動(dòng)物細(xì)胞易破碎，只需用溫和方法植物細(xì)胞較難破碎，須用中等或強(qiáng)度大的方法微生物細(xì)胞較復(fù)雜，一般用較強(qiáng)的方法第37頁(yè)/共48頁(yè)目的物的特性⑴．細(xì)胞中的位置游離狀：只需溫和破碎，除去不溶部分。結(jié)合狀：可能結(jié)合在膜或細(xì)胞器內(nèi)，需先收集膜或細(xì)胞器，再破碎⑵．敏感性溫度、pH、氧、剪切力、雜酶等影響⑶．處理量有些處理量大，如組織搗碎機(jī)、勻漿器等。有些處理量少，如超聲波破碎等。第38頁(yè)/共48頁(yè)2.3提取劑2.3.1組成要求：目的物溶于其中，?；钚?，減雜質(zhì)?？紤]因素如下：（1）．離子強(qiáng)度影響物質(zhì)溶解度的主要因素，適當(dāng)?shù)牡碗x子強(qiáng)度溶液（0.05～0.2mol/L）除增加溶解度，還對(duì)活性有穩(wěn)定作用。第39頁(yè)/共48頁(yè)（2）．pH 影響目的物的溶解度及穩(wěn)定性。 一般控制在pI附近的穩(wěn)定性范圍內(nèi)。（3）．添加劑 抑制劑（主要水解酶抑制劑），如提取核酸時(shí)，添加核酸酶抑制劑防目的物被分解。 保護(hù)劑（穩(wěn)定性），如對(duì)含巰基的酶添加谷胱甘肽等巰基保護(hù)劑第40頁(yè)/共48頁(yè)2.3.2用量目標(biāo) 收率（80%以上）且目的物濃度大動(dòng)物、微生物—加1.5～3體積的提取劑；植物—加入0.5～1體積的提取劑。第41頁(yè)/共48頁(yè)2.4提取液的澄清動(dòng)物、微生物提取液往往較混濁，需澄清 沉降速度：V=d2(σ-ρ)ω2γ/18η 顯然：加大ω或d或減小η都可增加V方法：㈠．粒子聚結(jié)（增大d）25%(NH4)2SO4處理酸化法適用于動(dòng)物細(xì)胞第42頁(yè)/共48頁(yè)㈡．降低提取液粘度NA（DNA、RNA），類(lèi)樹(shù)膠等易造成粘度大