實(shí)驗(yàn)二：葉綠體的分離與熒光觀察課件

實(shí)驗(yàn)二葉綠體的分離與熒光觀察細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.通過植物細(xì)胞葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法。2.觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞器分離的過程包括兩個(gè)主要階段：破碎細(xì)胞和細(xì)胞組分的分離在等滲溶液中進(jìn)行組織勻漿、分離葉綠體的分離采用差速離心或密度梯度離心法進(jìn)行利用熒光顯微鏡觀察葉綠體的自發(fā)熒光和間接熒光（次生/誘發(fā)熒光）離心分離技術(shù)離心是分離細(xì)胞組分和生物大分子最常用的分離方法，因?yàn)椴煌募?xì)胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同離心力不同介質(zhì)沉降分離。分離各種細(xì)胞組分的方法主要有：差速離心密度梯度離心速率-區(qū)帶梯度離心等密度離心差速離心主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達(dá)到分離不同大小顆粒的目的。差速離心的分辨率不高，沉降系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取密度梯度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞勻漿液混懸或置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞器分層、分離的方法。這類分離又可分為速率-區(qū)帶梯度離心和等密度梯度離心兩種。優(yōu)點(diǎn)是一次離心可分離提純樣品中幾種組份，用于較精細(xì)的分離。兩種密度梯度離心方法的異同特點(diǎn)速率-區(qū)帶梯度離心等密度離心分離方法的主要依據(jù)主要依賴分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同依賴于樣品顆粒的不同密度來進(jìn)行離心分離的

介質(zhì)密度梯度選擇最大密度必須小于樣品中粒子的最小密度；梯度平緩覆蓋了待分離物質(zhì)的密度；梯度陡度較高離心介質(zhì)的主要作用減緩顆粒擴(kuò)散速度阻止顆粒移動(dòng)；篩選與分離顆粒分辨率范圍沉降系數(shù)相差～20%的物質(zhì)顆粒密度差異大于1%離心后區(qū)帶形成位置易變(樣品易擴(kuò)散）不變（樣品不擴(kuò)散）影響樣品區(qū)帶形成的主要因素離心時(shí)間（過長或過短都不利）顆粒樣品密度一般操作方法介質(zhì)梯度應(yīng)預(yù)先形成，離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心后形成區(qū)帶。介質(zhì)梯度不需預(yù)先制備，離心時(shí)把密度均一的介質(zhì)液和樣品混合后裝入離心管，通過離心自形成梯度，讓顆粒在梯度中進(jìn)行再分配。常用介質(zhì)蔗糖、甘油蔗糖、甘油、CsCl、硫酸銫、溴化銫、三碘苯衍生物等。表1:各種亞細(xì)胞構(gòu)造在不同的離心介質(zhì)中分離所需的離心力與時(shí)間結(jié)構(gòu)差速離心(在0.25M蔗糖溶液中)速率-區(qū)帶梯度離心(5～50%蔗糖)等密度離心(其他介質(zhì),如CsCl等)細(xì)胞核800-1000g×10min500g×10min4000g×60min線粒體10,000g×20min5000g×10min80000g×100min溶酶體10,000g×20min5000g×10min80000g×100min質(zhì)膜(大片)100,000g×15min～100,000g×100min～150,000g×600min內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段150,000g×40min1000g×20min100,000g×200min微粒體100,000g×60min10,000g×30min100,000g×360min小顆粒100,000g×60min各種細(xì)胞器、大分子和病毒的密度及相應(yīng)的沉降系數(shù)

圖:各種細(xì)胞器、大分子和病毒的密度及相應(yīng)的沉降系數(shù)

根據(jù)1924年Svedberg（離心法創(chuàng)始人--瑞典蛋白質(zhì)化學(xué)家）對(duì)沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動(dòng)的速度。以每單位重力的沉降時(shí)間表示，并且通常為1～200×10-13秒范圍，10-13這個(gè)因子叫做沉降單位S,即1S=10-13秒看圖思考：要將細(xì)胞勻漿液中的得到更純的分離，選用哪種離心方法較好？(線粒體:1.18g/ml、溶酶體:1.12g/ml、微體:1.23g/ml)熒光熒光顯微鏡觀察熒光現(xiàn)象：某些物質(zhì)在一定短波長的光（如紫外光）的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，就能在極短的時(shí)間內(nèi)放射出比照射光波長更長的光（如可見光），這種光就稱為熒光。若停止供能，熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后，可直接發(fā)出熒光,稱為自發(fā)熒光。如葉綠素的火紅色熒光。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光，稱為間接熒光。如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)橘紅色熒光。1.兩組光源:透射照明光源(鹵素?zé)?；熒光光源(超高壓直流汞燈或氙燈)；2.有特殊的濾光片:激發(fā)濾色片和阻斷濾片3.激發(fā)光波長：較短，因此，分辨力高于普通顯微鏡；4.熒光光源照明方式：通常為落射式。紫外光(UV)：激發(fā)光譜區(qū)域：330-400nm;

紫光(V)：激發(fā)光譜區(qū)域：395-415nm;

藍(lán)光(B)：激發(fā)光譜區(qū)域：420-485nm;綠光(G)：激發(fā)光譜區(qū)域：460-550nm；熒光顯微鏡的特點(diǎn)：圖：落射式熒光顯微鏡的光路熒光染料:吖啶橙(acridineorange)吖啶橙是一種與DNA和RNA都能結(jié)合的熒光染料在紫外光或藍(lán)光(330～485nm)激發(fā)下，DNA可被激發(fā)出530nm的熒光發(fā)射峰(細(xì)胞核發(fā)亮綠色熒光)，RNA可被激發(fā)出640nm的熒光發(fā)射峰(核仁和胞質(zhì)RNA發(fā)桔紅色熒光)。產(chǎn)生兩種不同熒光是由于吖啶橙與雙鏈DNA和單鏈DNA或RNA的結(jié)合方式和結(jié)合量不同而決定的。DNA是高度聚合物，它與DNA結(jié)合是潛入雙鏈之間，結(jié)合量相對(duì)少；而與單鏈DNA或RNA的結(jié)合則由靜電吸引堆積在磷酸根上，結(jié)合量相對(duì)多些。我們推測，葉綠體的次生熒光的來由，大部分來自葉綠體的吸附作用，極少部分來自葉綠體中的RNA.實(shí)驗(yàn)用品材料：菠菜葉片試劑：蒸餾水，0.35mol/L氯化鈉溶液，0.01%吖啶橙(AO)

儀器：普通離心機(jī)，組織搗碎機(jī)，天平，熒光顯微鏡，顯微鏡，鑷子，培養(yǎng)皿，紙，移液管，滴管，燒杯，無熒光載片，蓋玻片，離心管,吸水紙等配制方法：稱取0.1g吖啶橙加蒸餾水100ml做干液，放冰箱備用，臨用前取1ml干液加1/15mol/L磷酸緩沖液（pH4.8）9ml。菠菜葉片(去葉脈)3g

→0.35mol/L氯化鈉15ml→研磨(冰浴)→勻漿過濾(2層尼龍網(wǎng))→濾液在1000rpm離心2min→棄沉淀，上清液3000rpm離心5min

→去上清液→沉淀為葉綠體(混有部分細(xì)胞核)，用0.35mol/L氯化鈉溶液懸浮

→滴片觀察取葉綠體懸液1滴置于載玻片上，加蓋玻片后用分別用普通光學(xué)顯微鏡觀察葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和熒光顯微鏡觀察自發(fā)熒光將葉綠體懸液滴在無熒光的載玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙熒光染料，蓋上無熒光的蓋玻片,使用熒光顯微鏡觀察間接熒光取葉表皮臨時(shí)裝片熒光染色觀察

實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖型，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色顆粒，即基粒。熒光顯微鏡下，選用藍(lán)色激發(fā)濾光片，葉綠體自發(fā)熒光為火紅色，間接熒光為桔紅色。細(xì)胞核呈黃綠色。圖：葉綠體自發(fā)熒光為火紅色葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉)中進(jìn)行,以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。分離過程最好在0~5℃的條件下進(jìn)行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察。離心機(jī)使用：離心管要平衡熒光顯微鏡使用熒光顯微鏡檢要在光線盡量暗的環(huán)境下進(jìn)行使用熒光顯微鏡時(shí)要注意不要直接觀察激發(fā)光源，保護(hù)眼睛凡是熒光染料都有一定毒性，請(qǐng)做好防護(hù)利用熒光顯微鏡對(duì)可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行檢測時(shí)，將受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等在熒光觀察時(shí)應(yīng)抓緊時(shí)間,有必要時(shí)立即拍照。在制作熒光顯微標(biāo)本時(shí)最好使用無熒光載片、蓋片和無熒光油。汞