酶工程學第十十一周固定化

第一節(jié)概述第二節(jié)固定化酶的性質(zhì)及其影響因素第三節(jié)固定化酶的制備第四節(jié)固定化細胞第五節(jié)固定化輔酶和原生質(zhì)體第六節(jié)酶反應器和固定化酶（細胞）的應用內(nèi)容提要現(xiàn)在是1頁\一共有91頁\編輯于星期三生物催化劑細胞酶非生長生長可溶固定化懸浮固定化連續(xù)間歇吸附包埋交聯(lián)化學連續(xù)材料膜固定酶液凝膠吸附化學連接物固定化再循環(huán)系統(tǒng)凝膠吸附連續(xù)半連續(xù)分批間歇連續(xù)活塞模式攪拌連續(xù)反應器間歇連續(xù)活塞模式攪拌連續(xù)反應器圖6-1生物催化劑作用方式示意現(xiàn)在是2頁\一共有91頁\編輯于星期三第一節(jié)概述游離酶的缺點：1.酶的穩(wěn)定性較差，在溫度、pH、和無機離子等外界因素的影響下，容易變性失活。2.酶一般都是在水溶液中與底物反應，反應結(jié)束后酶難以回收。3.反應結(jié)束后，酶成為產(chǎn)物的雜質(zhì)?，F(xiàn)在是3頁\一共有91頁\編輯于星期三固定化酶：固定化酶是指固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行催化反應的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有增強穩(wěn)定性，可反復或連續(xù)使用以及易于和反應產(chǎn)物分開等顯著特點。直接固定菌體或菌體碎片的，稱為固定化菌體或固定化死細胞?，F(xiàn)在是4頁\一共有91頁\編輯于星期三水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)現(xiàn)在是5頁\一共有91頁\編輯于星期三固定化酶的優(yōu)缺點多次使用可以裝塔連續(xù)反應優(yōu)點：純化簡單提高產(chǎn)物質(zhì)量應用范圍廣缺點：首次投入成本高大分子底物較困難現(xiàn)在是6頁\一共有91頁\編輯于星期三第二節(jié)固定化酶的制備一、一般方法及特點二、酶的固定化方法現(xiàn)在是7頁\一共有91頁\編輯于星期三一、選擇方法依據(jù)：（1）酶的性質(zhì)（2）載體的性質(zhì)（3）制備方法的選擇現(xiàn)在是8頁\一共有91頁\編輯于星期三二、酶的固定化方法（一）吸附法（二）結(jié)合法（三）交聯(lián)法（四）包埋法現(xiàn)在是9頁\一共有91頁\編輯于星期三（一）吸附法1.物理吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。

選擇載體的原則：（1）要有巨大的比表面積（2）要有活潑的表面（3）便于裝柱進行連續(xù)反應?，F(xiàn)在是10頁\一共有91頁\編輯于星期三常用載體：活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石優(yōu)點：缺點：結(jié)合力不勞、容易脫落。吸附法常用的載體及優(yōu)、缺點操作簡單、條件溫和、載體廉價易得、可反復使用?，F(xiàn)在是11頁\一共有91頁\編輯于星期三（二）結(jié)合法離子鍵結(jié)合法共價鍵結(jié)合法定義：選擇適宜載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法稱為結(jié)合法。現(xiàn)在是12頁\一共有91頁\編輯于星期三1.離子鍵結(jié)合法概念：通過共價鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法。常用載體:DEAE-纖維素，DEAE-葡聚糖凝膠使用注意：pH、離子強度、溫度++++++++++++----------------++++++++現(xiàn)在是13頁\一共有91頁\編輯于星期三2.共價鍵結(jié)合法概念：通過共價鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法?？梢孕纬晒矁r鍵的基團：游離氨基，游離羧基，巰基，咪唑基，酚基，羥基，甲硫基，吲哚基，二硫鍵常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無機載體現(xiàn)在是14頁\一共有91頁\編輯于星期三共價鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式”首先載體上引進活潑基團然后活化該活潑基團最后此活潑基團再與酶分子上某一基團形成共價鍵現(xiàn)在是15頁\一共有91頁\編輯于星期三載體活化的方法A．重氮法B．疊氮法C．烷基化反應法D．硅烷化法E．溴化氰法現(xiàn)在是16頁\一共有91頁\編輯于星期三A．重氮法反應式：現(xiàn)在是17頁\一共有91頁\編輯于星期三目前在我們國內(nèi)用的較多的載體：該方法需要載體具有芳香族氨基氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素瓊脂糖葡聚糖凝膠瓊脂……現(xiàn)在是18頁\一共有91頁\編輯于星期三反應式及原理現(xiàn)在是19頁\一共有91頁\編輯于星期三B疊氮法例：用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶步驟如下：酯化肼解疊氮化偶聯(lián)現(xiàn)在是20頁\一共有91頁\編輯于星期三C．烷基化反應法含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進行活化，形成含有鹵素基團的活化載體?，F(xiàn)在是21頁\一共有91頁\編輯于星期三D．硅烷化法載體特點：①機械強度好，表面積大。②耐有機溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長等。常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。現(xiàn)在是22頁\一共有91頁\編輯于星期三現(xiàn)在是23頁\一共有91頁\編輯于星期三現(xiàn)在是24頁\一共有91頁\編輯于星期三現(xiàn)在是25頁\一共有91頁\編輯于星期三E．溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能?，F(xiàn)在是26頁\一共有91頁\編輯于星期三現(xiàn)在是27頁\一共有91頁\編輯于星期三（三）交聯(lián)法定義：借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。現(xiàn)在是28頁\一共有91頁\編輯于星期三1.交聯(lián)法常用試劑戊二醛己二胺順丁烯二酸酐雙偶氮苯4,4ˊ-雙(二甲氨基)偶氮苯現(xiàn)在是29頁\一共有91頁\編輯于星期三2.交聯(lián)法的形式交聯(lián)法有2種形式：酶直接交聯(lián)法酶輔助蛋白交聯(lián)法現(xiàn)在是30頁\一共有91頁\編輯于星期三酶直接交聯(lián)法：在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強度、溫度和反應時間之間的平衡。EEEEEE現(xiàn)在是31頁\一共有91頁\編輯于星期三酶輔助蛋白交聯(lián)法：為避免分子內(nèi)交聯(lián)和在交聯(lián)過程中因化學修飾而引起酶失活，可使用第二個"載體"蛋白質(zhì)（即輔助蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來增加蛋白質(zhì)濃度，使酶與惰性蛋白質(zhì)共交聯(lián)。EEE現(xiàn)在是32頁\一共有91頁\編輯于星期三（四）包埋法定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。瓊脂瓊脂糖海藻酸鈉角叉菜膠明膠聚丙烯酰胺……載體：現(xiàn)在是33頁\一共有91頁\編輯于星期三1．網(wǎng)格型定義：將酶或含酶菌體包埋在凝膠細微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法?，F(xiàn)在是34頁\一共有91頁\編輯于星期三2．微囊型包埋法定義：將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法?，F(xiàn)在是35頁\一共有91頁\編輯于星期三微囊化法制備固定化酶有兩種方法界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有機相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。界面聚合法：是用化學手段制備微囊的方法。利用油水界面上發(fā)生聚合反應形成聚合體而將酶包裹起來。癸二酰氯，氯仿酶，水，乙二胺現(xiàn)在是36頁\一共有91頁\編輯于星期三第三節(jié)固定化酶的性質(zhì)及其影響因素一、影響固定化酶性質(zhì)的因素二、固定化后酶性質(zhì)的變化三、評價固定化酶的指標現(xiàn)在是37頁\一共有91頁\編輯于星期三一、影響固定化酶性質(zhì)的因素1．酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。2．載體的影響（1）分配效應（2）空間障礙效應（3）擴散限制效應3.固定化方法的影響現(xiàn)在是38頁\一共有91頁\編輯于星期三二、固定化后酶性質(zhì)的變化1．固定化對酶活性的影響：酶活性下降，反應速度下降原因：酶結(jié)構(gòu)的變化空間位阻2．固定化對酶穩(wěn)定性的影響（1）操作穩(wěn)定性提高（2）貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。（3）對熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。（4）對分解酶的穩(wěn)定性提高。（5）對變性劑的耐受力升高現(xiàn)在是39頁\一共有91頁\編輯于星期三三、固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因固定化后酶分子與載體多點連接。酶活力的釋放是緩慢的。抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性?，F(xiàn)在是40頁\一共有91頁\編輯于星期三四、pH的影響（一）pH對酶活性的影響：（1）改變酶的空間構(gòu)象（2）影響酶的催化基團的解離（3）影響酶的結(jié)合基團的解離（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物?，F(xiàn)在是41頁\一共有91頁\編輯于星期三（二）pH對固定化酶的影響1.載體帶負電荷，pH向堿性方向移動。2.載體帶正電荷，pH向酸性方向移動。

微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。現(xiàn)在是42頁\一共有91頁\編輯于星期三催化反應的產(chǎn)物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高。催化反應的產(chǎn)物為堿性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值低。（三）產(chǎn)物性質(zhì)對體系pH的影響現(xiàn)在是43頁\一共有91頁\編輯于星期三（四）最適溫度變化作用于低分子底物的酶，特異性沒有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶，特異性往往會變化。一般與游離酶差不多，但有些會有較明顯的變化。（五）底物特異性變化現(xiàn)在是44頁\一共有91頁\編輯于星期三（六）米氏常數(shù)Km的變化，Km值隨載體性質(zhì)變化（1）載體與底物帶相同電荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力。（2）載體與底物電荷相反，靜電作用，Km’<Km?，F(xiàn)在是45頁\一共有91頁\編輯于星期三五、評價固定化酶的指標：1.酶活定義（IU)：在特定條件下，每一分鐘催化一個微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個酶活單位。2.酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力單位（一）游離酶現(xiàn)在是46頁\一共有91頁\編輯于星期三1.固定化酶的比活：

每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位。或：單位面積（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：

連續(xù)測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間（t1/2），是衡量穩(wěn)定性的指標。（二）固定化酶現(xiàn)在是47頁\一共有91頁\編輯于星期三5.相對酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力

3.4.酶活力回收率也稱偶聯(lián)效率，活力保留百分數(shù)?，F(xiàn)在是48頁\一共有91頁\編輯于星期三六、固定化酶的活力測定方法介紹1.振蕩測定法：2.酶柱測定法：3.連續(xù)測定法：利用連續(xù)分光光度法等測定方法可以對固定化酶反應液進行連續(xù)測定，從而測定固定化酶的酶活力?，F(xiàn)在是49頁\一共有91頁\編輯于星期三第四節(jié)微生物、植物和動物細胞固定化細胞特性比較細胞種類植物細胞微生物細胞動物細胞細胞大小/um20-3001-1010-100倍增時間/h>120.3-6>15營養(yǎng)要求簡單簡單復雜光照要求大多數(shù)要光照不要求不要求對剪切力敏感大多數(shù)不敏感敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗體、酶現(xiàn)在是50頁\一共有91頁\編輯于星期三固定化細胞定義：固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞稱為固定化細胞.該細胞能進行正常的生長、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細胞或固定化增殖細胞?，F(xiàn)在是51頁\一共有91頁\編輯于星期三固定化細胞的特點類型：微生物細胞、植物細胞、動物細胞生理狀態(tài)：死細胞（完整細胞、細胞碎片、細胞器）活細胞（增殖細胞、靜止細胞、完整細胞）形狀：顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則形狀。

使用周期：理論上講，固定化增殖細胞保持了細胞原有的全部活性，只要載體不解體，不污染就可以長期使用?，F(xiàn)在是52頁\一共有91頁\編輯于星期三細胞固定化方法吸附法包埋法現(xiàn)在是53頁\一共有91頁\編輯于星期三吸附法定義：通過載體與細胞間的靜電引力，即細胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細胞固定在載體上的。pH3－5------------++++++++現(xiàn)在是54頁\一共有91頁\編輯于星期三影響吸附法的主要因素

Z-電位：Z-電位能近似地代表表面電荷密度的大小細胞的性質(zhì)和細胞壁的組成：細胞壁的電荷性質(zhì)載體的性質(zhì)：特別是玻璃、陶瓷等無機材料現(xiàn)在是55頁\一共有91頁\編輯于星期三包埋固定法

包理法是在細胞自身并不與凝膠基體發(fā)生化學鍵合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）內(nèi)的一種固定化方法。包埋法的最大優(yōu)點是能較好的保持細胞內(nèi)多酶系統(tǒng)的活力，可象游離細胞那樣進行產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)?，F(xiàn)在是56頁\一共有91頁\編輯于星期三包埋法常用載體：瓊脂海藻酸鈣角叉菜膠明膠聚丙烯酰胺現(xiàn)在是57頁\一共有91頁\編輯于星期三舉例：海藻酸鈣包埋法基本原理是：稱取一定量的海藻酸鈉配成水溶液，經(jīng)殺菌冷卻后，與一定體積的細胞或孢子懸浮液混合均勻，然后用注射器或滴管將冷懸液滴入一定濃度的凝固浴中（常用CaCl2溶液），形成球狀固定化細胞?，F(xiàn)在是58頁\一共有91頁\編輯于星期三研究熱點——光交聯(lián)樹脂包埋法

例：相對分子量為1000-3000的光交聯(lián)聚氨酯預聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50℃，然后與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得?，F(xiàn)在是59頁\一共有91頁\編輯于星期三第五節(jié)固定化原生質(zhì)體和輔酶一、原生質(zhì)體的制備二、固定化三、輔酶固定化現(xiàn)在是60頁\一共有91頁\編輯于星期三一、原生質(zhì)體的制備將對數(shù)生長期的細胞收集——懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中——加入水解酶——分離——得到原生質(zhì)體現(xiàn)在是61頁\一共有91頁\編輯于星期三二、原生質(zhì)體固定化的方法將原生質(zhì)替制備好后，把離心收集到的原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液，然后采用包埋法制成固定化原生質(zhì)體?，F(xiàn)在是62頁\一共有91頁\編輯于星期三三、輔酶固定化原因有機輔因子中具有某些特殊的化學基團，參與酶的催化反應有機輔因子在使用過程中要流失，并且不能自行再生有機輔因子價格昂貴——工業(yè)上應用全酶的關(guān)鍵是有機輔因子的保留和再生現(xiàn)在是63頁\一共有91頁\編輯于星期三輔酶固定化的方法固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M行適當?shù)幕瘜W修飾后固定在超濾器中。輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。

現(xiàn)在是64頁\一共有91頁\編輯于星期三輔酶的固定化現(xiàn)在是65頁\一共有91頁\編輯于星期三現(xiàn)在是66頁\一共有91頁\編輯于星期三輔酶固定化的形式現(xiàn)在是67頁\一共有91頁\編輯于星期三第六節(jié)酶反應器和固定化酶（細胞）的應用酶反應器介紹反應器選擇的依據(jù)反應器和酶穩(wěn)定性固定化酶和細胞的應用（工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、分析化學、酶電極、親和色譜、環(huán)境保護、能源開發(fā)、基礎理論研究）現(xiàn)在是68頁\一共有91頁\編輯于星期三一、酶反應器1．分批攪拌反應器。2．連續(xù)流攪拌桶反應器。3．連續(xù)攪拌桶-超濾反應器4．填充床反應器5．循環(huán)反應器6．流化床反應器定義：用于各種酶進行催化反應的容器及其附屬設備。類型：現(xiàn)在是69頁\一共有91頁\編輯于星期三1．分批攪拌反應器反應器結(jié)構(gòu)簡單，不需要特殊裝置，適與小規(guī)模試驗現(xiàn)在是70頁\一共有91頁\編輯于星期三2．連續(xù)流攪拌桶反應器現(xiàn)在是71頁\一共有91頁\編輯于星期三3．連續(xù)攪拌桶-超濾反應器酶循環(huán)現(xiàn)在是72頁\一共有91頁\編輯于星期三4．填充床反應器現(xiàn)在是73頁\一共有91頁\編輯于星期三5．循環(huán)反應器現(xiàn)在是74頁\一共有91頁\編輯于星期三6．流化床反應器與連續(xù)流攪拌桶式反應器類似，是讓適量的顆粒狀酶懸浮于反應床中，不用攪拌器，而是底物向上流過固定酶床，因此流速要適當控制。現(xiàn)在是75頁\一共有91頁\編輯于星期三反應器選擇酶的形式：底物的物理性質(zhì)：酶反應動力學酶的穩(wěn)定性操作要求、應用和可塑性成本現(xiàn)在是76頁\一共有91頁\編輯于星期三反應器和酶的穩(wěn)定性反應器中酶催化活性損失的原因：酶本身失效酶從載體上脫落載體肢解擴散限制效應現(xiàn)在是77頁\一共有91頁\編輯于星期三二、固定化酶（細胞）的應用1.

固定化酶（細胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應用2．固定化酶在醫(yī)藥治療上的應用3．固定化酶在分析化學中應用4．固定化酶和親和色譜5．固定化酶與環(huán)境保護6．新能源開發(fā)中的應用7．固定化酶在基礎理論研究中應用現(xiàn)在是78頁\一共有91頁\編輯于星期三1．固定化酶（細胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應用葡萄糖異構(gòu)酶——世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶固定化酵母細胞等微生物可用于生產(chǎn)各種酒類熱點：固定化原生質(zhì)體的應用現(xiàn)在是79頁\一共有91頁\編輯于星期三2．固定化酶在醫(yī)藥治療上的應用例1固定化青霉素?；福灰淖僷H值等條件，就可以生成不同的產(chǎn)物?，F(xiàn)在是80頁\一共有91頁\編輯于星期三青霉素?；复呋铣深^孢類抗生素

7-ACAasnucleus現(xiàn)在是81頁\一共有91頁\編輯于星期三7-ACCAor7-ADCAasnuc