遺傳的制作和基因定位下1課件

4.5細(xì)菌的遺傳分析與基因定位4.5.1細(xì)菌的轉(zhuǎn)化和基因定位轉(zhuǎn)化：指某些細(xì)菌能通過其細(xì)胞膜攝取周圍供體的染色體片段，將此外源DNA片段通過重組加入自己染色體組的過程。1928年，格里費(fèi)斯(GriffithF.)在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。1944年，阿委瑞(AveryO.T.)成功地進(jìn)行了肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)；證實(shí)遺傳物質(zhì)是DNA；轉(zhuǎn)化是細(xì)菌交換基因的方法之一。

細(xì)菌中的大部分的轉(zhuǎn)化工作是用下面三種細(xì)菌完成的：肺炎雙球菌，枯草桿菌和流感嗜血桿菌。轉(zhuǎn)化主要分為二個步驟進(jìn)行:(一)供體DNA與受體細(xì)胞間的接觸與互作肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化：DNA片斷至少有800個堿基對；枯草桿菌的轉(zhuǎn)化：DNA片斷至少有16000個堿基對。轉(zhuǎn)化的第一步是使轉(zhuǎn)化DNA與受體細(xì)菌間的成功地相互作用，這包括：轉(zhuǎn)化片段的大小、形態(tài)、濃度和受體細(xì)胞的生理狀態(tài)。

①.轉(zhuǎn)化片斷的大小：②.供體DNA分子存在的數(shù)目：對特定基因來說，供體DNA分子數(shù)目與成功轉(zhuǎn)化有關(guān)。鏈霉素抗性基因轉(zhuǎn)化：在每個細(xì)胞含有10個DNA分子之前，抗性轉(zhuǎn)化體數(shù)目一直與DNA分子存在數(shù)目成正比。原因：在細(xì)菌的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上有固定數(shù)量的DNA接受座位，故一般細(xì)菌攝取的DNA分子數(shù)小于10個。③．受體的生理狀態(tài)：受體細(xì)胞必須在生理上處于感受態(tài)。這種感受態(tài)只能發(fā)生在細(xì)菌生長周期的某一時間范圍內(nèi)，在感受態(tài)內(nèi)，活躍合成的蛋白質(zhì)的細(xì)菌細(xì)胞壁多少發(fā)生改變而易于接受轉(zhuǎn)化DNA。(三)轉(zhuǎn)化和基因重組作圖例如：黎德伯格等用枯草桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化和重組試驗(yàn)DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞之后，可與受體染色體發(fā)生重組。緊密連鎖的兩個基因有較多的機(jī)會包括在同一個DNA片段中，并同時整合到受體染色體中。Trp2his2tyr1<-----------34-----------><----13-------><--------------------40--------------------->三者并發(fā)轉(zhuǎn)化的頻率最高，故這3個基因是連鎖的，其中his2和tyr1連鎖緊密：單交換時，染色體開環(huán)易降解，故不存在單交換類型；只有雙交換和偶數(shù)的多交換才有效的。B菌株：Met+bio+thr-leu-，需加蘇氨酸和亮氨酸。不同營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌：A菌株：Met-bio-thr+leu+，需加甲硫氨酸和生物素。4.5.2.1黎德伯格和塔特姆（1946年）：A菌株和B菌株?duì)I養(yǎng)缺陷型，不能在基本培養(yǎng)上生長。A+B菌株混合培養(yǎng)，在完全培養(yǎng)基上，幾小時后離心，涂布基本培養(yǎng),長出原養(yǎng)型(Met+bio+thr+leu+)菌落。這種原養(yǎng)型細(xì)胞如何出現(xiàn)？轉(zhuǎn)化？細(xì)胞間直接接觸而發(fā)生遺傳物質(zhì)交換和重組?A、B菌株分別培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基上

一邊加壓和吸引使培養(yǎng)液充分混合

結(jié)果任何一臂的培養(yǎng)基上均未長出原養(yǎng)型細(xì)菌?！嘀苯咏佑|(接合)是原養(yǎng)型細(xì)胞出現(xiàn)的必要條件。大分子可通過，細(xì)菌不能通過Hayes(1952)試驗(yàn)證明：接合過程是一種單向轉(zhuǎn)移，A菌株遺傳物質(zhì)

B菌株，從供體“donor”到受體“receptor”。4.5.2.3F因子的三種狀態(tài)：以大腸桿菌為例：②．一個自主狀態(tài)F因子，即F＋；

③．帶有一個整合的F因子的細(xì)胞叫高頻重組細(xì)胞，Hfr細(xì)胞。①．沒有F因子，即F－；⑷．自主狀態(tài)時F因子獨(dú)立進(jìn)行分裂。F＋×F－：先形成接合管，F(xiàn)因子的DNA邊轉(zhuǎn)移邊復(fù)制，F(xiàn)－細(xì)胞

F＋細(xì)胞。F因子整合到細(xì)菌染色體上(F＋

Hfr細(xì)胞)，其繁殖與細(xì)菌染色體同步進(jìn)行。此時，細(xì)菌基因的重組頻率增加4倍以上，因此染色體上整合有F因子的菌株，稱為Hfr菌株。㈡、Hfr細(xì)胞的形成及染色體的轉(zhuǎn)移：部分二倍體中發(fā)生交換:單數(shù)交換：打開環(huán)狀染色體，產(chǎn)生一個線性染色體，這種細(xì)胞是不能成活的。偶數(shù)交換：產(chǎn)生可遺傳的重組體和片段。部分二倍體：當(dāng)F＋或Hfr的細(xì)菌染色體進(jìn)入F－后，在一個短時期內(nèi)，F(xiàn)－細(xì)胞內(nèi)的某些位點(diǎn)就會成為二倍體的DNA。4.5.2.5中斷雜交作圖一、中斷雜交實(shí)驗(yàn)原理

基因從Hfr細(xì)胞按次序轉(zhuǎn)入F-細(xì)胞，可根據(jù)基因進(jìn)入F-細(xì)胞的時間和次序制作基因圖譜。Wollman和Jacob于1954年在大腸桿菌中曾進(jìn)行了以下雜交實(shí)驗(yàn)：Hfr：thr+leu+azsTislac+gal+strs×F-:thr-leu-azrTirlac-gal-strr把接合中的細(xì)菌在不同時間取樣，并把樣品猛烈攪拌以中斷接合中的細(xì)菌，然后分析受體菌的基因型，這是在大腸桿菌等細(xì)菌中用來測定基因位置的一種方法。二、中斷雜交作圖中斷雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果基因轉(zhuǎn)入時間（min）頻率thr+8100leu+8.5100azs990Tis1170lac+1840gal+2525不同基因在F-中出現(xiàn)的時間和達(dá)到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)移頻率不同，表明它們同轉(zhuǎn)移起始點(diǎn)之間，以及它們之間的順序和距離不同。

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OazTilacgalE.coli中斷雜交作圖基因距離以分鐘為單位同一個Hfr菌株的轉(zhuǎn)移的起始點(diǎn)在以及轉(zhuǎn)移順序在不同實(shí)驗(yàn)中都是相同的。但一個F+品系可產(chǎn)生許多Hfr品系，這是因?yàn)镕因子在細(xì)菌染色體上有許多插入位點(diǎn)而且其插入取向不同而形成的。用這些不同Hfr菌株進(jìn)行中斷雜交實(shí)驗(yàn)，則它們的轉(zhuǎn)移起點(diǎn)、基因轉(zhuǎn)移順序以及轉(zhuǎn)移方向都不相同。4.5.2.6細(xì)菌的重組作圖

如果2個基因間的轉(zhuǎn)移時間<2min則用中斷雜交作圖不可靠，應(yīng)采用傳統(tǒng)的重組作圖法?！耠s交Hfrlac+ade+×F-lac-ade-

lac+乳糖不發(fā)酵ade-胸嘌呤缺陷型用完全培養(yǎng)基但不加腺嘌呤，可選出F-ade+的菌落●由于lac+ade-近，兩者相繼進(jìn)入時間相距很短，難以準(zhǔn)確界定，所以只能根據(jù)產(chǎn)物確定。●如果選出ade+同時也選出lac+，說明lac-ade間沒有發(fā)生過交換；如果是lac-ade+說明發(fā)生交換。Hfr

lac+ade+F-lac-ade-

F-lac-ade-Hfr

lac+ade+F-lac+ade+

F-lac-ade-Hfr

lac+ade+F-lac-ade+F-lac-ade-

A：外基因子與內(nèi)基因子之間未發(fā)生重組；B：lac-ade兩基因之外發(fā)生雙交換；C：lac-ade兩基因間發(fā)生交換產(chǎn)生重組子?！裰亟M率=lac-ade+/(lac+ade+)+(lac-ade+)×100%=22%

兩個位點(diǎn)之間的時間單位約為1min，可見1個時間單位（分鐘）大約相當(dāng)于20%的重組值。用重組率與中斷雜交法測的基因距離大致符合的，根據(jù)接合的實(shí)驗(yàn)，用中斷雜交法基因重組等方法已繪制出大腸桿菌K12環(huán)狀遺傳圖（圖4-42）。A:B:C:

LT22phe-try-tyr-

×

LT2met-his-

（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）

（甲硫氨酸、組氨酸）營養(yǎng)缺陷型↓

營養(yǎng)缺陷型

原養(yǎng)型的菌落（即出現(xiàn)個別正常型的細(xì)菌）

那么這些原養(yǎng)型菌落的出現(xiàn)是由接合引起的？還是由轉(zhuǎn)化引起的？他們先進(jìn)行U形管實(shí)驗(yàn)（P159），結(jié)果在LT22一臂獲得原養(yǎng)型的菌株，由此推測可能有一種可通過濾膜的過濾性因子（FA）在起作用。進(jìn)一步利用DNA酶處理，結(jié)果FA不受DNA酶影響，從而消除了轉(zhuǎn)化作用的可能性。最后認(rèn)為FA是一種噬菌體，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)導(dǎo)。3.轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制轉(zhuǎn)導(dǎo)是在噬菌體包裝中因?yàn)殄e誤將細(xì)菌染色體片段包裝進(jìn)去成為內(nèi)含細(xì)菌染色體片段“假噬菌體”而發(fā)生的。具體過程如下：

（1）噬菌體侵染細(xì)菌。（2）噬菌體DNA使細(xì)菌染色體形成片段，合成噬菌體DNA和外殼。（3）新噬菌體包裝，偶爾將細(xì)菌染色體片段也包裝進(jìn)去成為內(nèi)含細(xì)菌染色體片段“假噬菌體”。“假噬菌體”和真噬菌體一起釋放出來。

若同時觀察3因子轉(zhuǎn)導(dǎo)分析，則只做一次實(shí)驗(yàn)就可推出其次序。舉例：利用普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)測知leu，thr，azi三個基因順序。方法：（1）用噬菌體P1侵染帶leu+，thr+和azi+的大腸桿菌。（2）用從該大腸桿菌釋放出來的噬菌體，再侵染leu-、thr-和azi-的大腸桿菌。

(3)把受體菌接種到不含thr的選擇培養(yǎng)基上對thr+進(jìn)行選擇，凡具thr+的細(xì)菌都可生長，把此菌接種到其他培養(yǎng)基上，結(jié)果在選出的thr+重組子只有3%leu+，但無一個同時也是azi+。若選擇leu+重組子，則約有50%同時也是azi+，因此3基因次序應(yīng)為thr+leu+azi+。P1652.特異性（局限性）轉(zhuǎn)導(dǎo)１概念：只能轉(zhuǎn)移細(xì)菌染色體特定部分基因的轉(zhuǎn)導(dǎo).2局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程3轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制:是因?yàn)槭删w在細(xì)菌染色體的特定位點(diǎn)上整合。4低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)與高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)

噬菌體

↓感染供體菌→裂解液(轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體)→非溶源

(溶源菌)

(10-6)

性細(xì)菌溶源性轉(zhuǎn)導(dǎo)子重組性轉(zhuǎn)導(dǎo)子低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：指溶源性細(xì)菌經(jīng)誘導(dǎo)所釋放的噬菌體所

進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo).

4.6 噬菌體的重組作圖

4.6.1噬菌體的結(jié)構(gòu)和形態(tài)二．λ噬菌體

1951年EstherLederberg發(fā)現(xiàn)K12中有原噬菌體，并命名為λ。