高通量篩選技術課件

高通量篩選技術Highthroughputscreening王陶2012年2月

高通量篩選最初是伴隨組合化學而產生的一種藥物篩選方式。

1990年末，組合化學的出現(xiàn)改變了人類獲取新化合物的方式，人們可以通過較少的步驟、在短時間內同時合成大量化合物，在這樣的背景下高通量篩選的技術應運而生。

高通量篩選技術可以在短時間內對大量候選化合物完成篩選，經過近十年的發(fā)展，已經成為比較成熟的技術，不僅僅應用于對組合化學庫的化合物篩選，還更多地應用于對現(xiàn)有化合物庫的篩選。

目前世界各大藥物生產商都建立有自己的化合物庫和高通量篩選機構，對有潛力形成藥物的化合物進行篦梳式的篩選。我國藥物高通量篩選起步較晚，且不規(guī)范，僅有十多年的研究歷史。1996年中國醫(yī)學科學院引進國內第一臺Bionek2000型實驗自動化工作站；1998年又引進全國第一臺Topcount微量閃爍計數(shù)器，使放射配基實驗、放射免疫實驗等技術微量化、自動化。上海藥物研究所、北京軍事醫(yī)學科學院分別成立了藥物篩選專門機構，開始從事大規(guī)模篩選工作。西安交通大學藥學院賀浪沖教授首創(chuàng)的細胞膜色譜（CMC）為化合物的體外高通量篩選提供了高選擇性、高特異性、高效率的篩選手段。CMC已成功用于鈣離子拮抗劑受體配體結合反應的研究，目前正在進行心血管化學合成藥物的高通量篩選和中藥有效部位及有效成分的尋找。今年將建立CMC自動化篩選體系，促進我國藥物高通量篩選技術的全面發(fā)展。高通量細胞篩選技術(high-throughputcell-basedscreeningtechnology)是以高通量方式研究基因功能最有效的方法之一。通常,基因功能的初步篩選在96孔或384孔板上進行,通過基因轉染將候選基因導入細胞,或直接將基因表達產物加入細胞培養(yǎng)液中。

是20世紀80年代后期發(fā)展起來的一種篩選新技術。它集計算機控制、自動化操作、高靈敏度檢測、數(shù)據(jù)結果自動采集和處理于一體，實現(xiàn)了篩選的快速、微量、靈敏和大規(guī)律，日篩選量達到數(shù)萬甚至數(shù)十萬樣品次，是篩選技術和方法的一大進步。

篩選測定方法基于要研究的生物學或醫(yī)學問題,例如,要研究抗血管生成活性,選用內皮細胞進行細胞生長、分化、遷移和粘附等分析測定;研究免疫調節(jié)活性,可選擇淋巴細胞或造血細胞進行細胞生長和分化的分析測定;研究神經營養(yǎng)因子活性,可選用神經細胞進行細胞存活、突起生長測定。除上述與細胞表型或形態(tài)學相關的檢測指標外,細胞信號轉導通路、糖代謝、能量產生和代謝產物分析(metaboliccontrolanalysis)等代謝通路也是基因功能重要的研究內容。

結合抗體芯片技術、多路測定技術(multiplexing)等新的檢測方法,高通量細胞篩選的應用更為廣泛。另外,隨著熒光成像讀板儀(fluorescenceimageplatereader,FLIPR)、定量PCR、高通量熒光激活細胞分類器(HT-FACS)等檢測方法和技術的不斷發(fā)展和應用,靈敏度和重現(xiàn)性這兩個高通量細胞篩選的關鍵問題也逐步得以解決。Boekel微孔板振蕩器的特點

獨立設定溫度，振蕩速度和混合時間；

混勻器可以編程設定運行一定時間或者瞬時混合3秒；

內置的蓋可以減少污染，樣品揮發(fā)或者噪音的危險。

多通道移液器連續(xù)移液器一次性吸取大量液體，然后每次按動按鈕，僅僅釋放小量等體積的液體。大量液體進行等體積分裝多功能酶標儀（多功能微孔板檢測儀）微孔板檢測設備之一，集成4大功能模塊，可進行放射性/非放射性檢測。

流式細胞儀C6流式細胞儀系統(tǒng)是一種全功能、雙激光、六探測器的流式細胞儀分析系統(tǒng)，C6流式細胞儀系統(tǒng)的探測器不但可靈敏的捕獲前散射光和旁散射光，還有四個可調光學濾光片的熒光探測器。CFlow操作軟件使搜集數(shù)據(jù)和分析變的簡單快速。高集成度、高度自動化的主機，以及優(yōu)良人機界面、操作簡便的CFlow軟件系統(tǒng)

高通量平行合成儀液相芯片檢測儀微孔過濾板12通道藥物篩選儀條形碼技術

條形碼(barcode)是將寬度不等的多個黑條和空白，按照一定的編碼規(guī)則排列，用以表達一組信息的圖形標識符。常見的條形碼是由反射率相差很大的黑條（簡稱條）和白條（簡稱空）排成的平行線圖案。條形碼可以標出物品的生產國、制造廠家、商品名稱、生產日期、圖書分類號、郵件起止地點、類別、日期等許多信息，因而在商品流通、圖書管理、郵政管理、銀行系統(tǒng)等許多領域都得到了廣泛的應用。數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)SAS（StatisticalAnalysisSystem，統(tǒng)計分析系統(tǒng)）是當今國際最著名的數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng)。SAS：數(shù)據(jù)的輸入輸出和整理、描述性統(tǒng)計、假設檢驗、圖形的制作、回歸分析、多元統(tǒng)計分析、方差分析、協(xié)方差分析和時間序列分析等。數(shù)據(jù)訪問，數(shù)據(jù)管理，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)，數(shù)據(jù)分析SPSSEXCEL二、高通量篩選技術常用方法微孔板的使用和光學檢測法工程菌株的裂解報告基因流式細胞技術蛋白質芯片通過發(fā)射光的比率可以推出未知成分的濃度，因此測定化學反應過程中的發(fā)射光是非常有用的。反應過程中產生的光與發(fā)射光的量產率是直接相關的，相應的，與發(fā)光物質的濃度成比例。因此，反應過程中的光可以相對反映出目標樣品中發(fā)光物質的量?；瘜W發(fā)光儀使用范圍·ATP（三磷酸腺甙）檢驗、熒光素酶檢驗·免疫及proteomics·核酸，DNA及基因組·病毒研究（比如：SARS、禽流感病毒研究）·臨床診斷研究·染色體分析·毒性試驗·細胞活力試驗·餐館衛(wèi)生檢測·環(huán)境檢測·工業(yè)、農林業(yè)、畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等其它用途最廣泛的用途是對利用報告基因檢測目標基因的表達以及檢測細胞內ATP水平。微生物污染檢測ATP的發(fā)光檢測方法可以檢測樣品中的所有微生物，因而被用于檢測水中的大腸桿菌含量，包括飲用水和用于oilfieldinjection，coolingsystem以及紙加工過程的工業(yè)用水。ATP的發(fā)光檢測方法還可以用于藥品，化妝品，牛奶以及其它食品的微生物控制。三、高通量篩選的技術過程1、樣品庫2、初篩和復篩3、活性化合物4、深入篩選5、獲得少量先導化合物6、確證篩選藥物藥理學研究7、侯選藥物8、臨床前研究HTS篩選的基本步驟第一步是選擇分子靶。選擇的依據(jù)是來源于國際醫(yī)學生物學的新成果。目前國際常用的分子靶有以下幾類：A、細胞膜受體；B、離子通道蛋白；C、酶蛋白；D、細胞核受體；E、轉運蛋白。第二步是建立穩(wěn)定表達分子靶的生物體系。靶是蛋白---克隆相對應的蛋白，在大腸桿菌中表達和提純；靶是細胞受體---克隆出的基因轉化到載體細胞中，建立穩(wěn)定的細胞株。第三步建立簡便快速的大規(guī)模的生物檢測方法。根據(jù)靶的不同分為兩類：1、以蛋白等分子為基礎；2、以細胞為基礎酶蛋白---測定酶活性的變化；細胞膜受體---測定配體-受體的結合；細胞核受體---測定蛋白的表達。在建立大規(guī)模生物檢測方法的同時，要用組合化合物的方法合成大量不同結構的化合物庫相配套。HTS藥物篩選靶點與檢測方法（1）、分子靶點篩選模型---細胞信號通路篩選系統(tǒng)外界信號從細胞表面?zhèn)鬟f到細胞內，或者直接穿過細胞膜進入到細胞質和細胞核，最終影響某些基因的轉錄。在這個傳遞過程中，某些特殊的細胞或一些病理狀況下，可能是其中的一條或幾條通路起作用，藥物可以根據(jù)需要對這些通路進行阻斷。使用信號通路篩選系統(tǒng)，可直接對藥物作用的分子機制有所了解。（2）、細胞膜表面受體篩選模型

a.G蛋白耦聯(lián)受體：受體與GTP結合的調節(jié)蛋白的耦聯(lián)，在細胞內產生cAMP，從而將外界信號跨膜傳遞到細胞內。如趨化因子受體、β-受體阻斷劑等。b.催化受體：為單跨膜受體，分為胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞內區(qū)。當細胞因子與胞外區(qū)結合后，引起多個受體單體的聚合，每個聚合體的受體單體可以是同一類型，也可以不同。如EPO、G-CSF、GH受體2個同樣的單體；IL-1，GM-CSF，IL-6受體是2個不同的單體；TNF-α是3個同樣的單體；IL-2是3個不同的受體。c.離子通道耦聯(lián)受體：細胞表面一些神經遞質的受體，自身是一些離子通道，或者與離子通道相耦聯(lián)。當與配體結合時，受體構象改變，通道開放，離子進出細胞，引起電興奮。作業(yè)第四章微生物雜交育種

1、放線菌雜交方法有哪些？簡述每種方法的具體過程？第五章基因工程育種1、簡述基因體外定位誘變的方法。

第六章高通量篩選技術1、簡述表面展示技術的方法。2、什么是報告基因？作為報告基因，在遺傳選擇和篩選檢測方面應具備哪些條件？常見報告基因有哪些？本課程考核方式寫一篇與微生物遺傳育種相關的綜述。字數(shù)不低于4000字。期末成績=平時20%+實驗20%+論文60%評分辦法

課程論文占60%，其評分標準如下：1）選題新穎（熱點問題的研究、空白問題的探索、老問題的新視野）（10分）2）結構合理、行文流暢、邏輯嚴謹、學術語言規(guī)范（20分）3）觀點鮮明、資料翔實、立論深刻、有所創(chuàng)新（30分）4）注釋與參考文獻（文獻數(shù)量、種類、外文文獻）（10分）5）規(guī)范程度：題目、內容提要、關鍵詞、正文、注釋、參考文獻（20分）6）總結全文的主要論點和發(fā)展方向，指出目前研究中尚需解決的問題及研究成果的意義和價值。（10分）7）字數(shù)不少于4000字，每少100字扣1分。論文格式要求1、題名（黑體，小三，居中）2、姓名、班級、學號（仿宋、小四、居中）3、摘要：對全文進行概括，提出研究目的與意義，論文主要內容，150字左右（五號，楷體，首行縮進2字符，行距固定值20磅?！罢倍旨哟郑?、關鍵詞：3~8個（五號，楷體，首行縮進2字符，各關鍵詞之間加分號；最后一詞之后不加標點符號。“關鍵詞”三字加粗）5、正文五號宋體（全文所有西文字體均采用TimesNewRoman），首行縮進2字符，行距固定值20磅。6、前言：簡要介紹研究背景，研究現(xiàn)狀（不要與摘要重復）7、正文標題采用編碼格式，一級標題加粗，示例如下：

1空間誘發(fā)微生物突變的作用機制研究2微生物空間誘變的研究與進展2.1空間誘變對微生物產酶活性的影響2.2空間誘變對微生物產次級代謝產物活性的影響

2.3……3問題和展望3.1……9、正文最后要有結語（或展望）。對全文作總結，可指出目前研究中存在的問題，今后發(fā)展的方向。10、參考文獻格式按照國標GB7714-2005《參考文獻著錄規(guī)則》要求。參考文獻不少于10篇。[1]