級(jí)研究生實(shí)驗(yàn)一課件

PartIT細(xì)胞表型測(cè)定（一）PartII小鼠脾細(xì)胞分離技術(shù)實(shí)驗(yàn)一Tel：Email：PartIT細(xì)胞表型測(cè)定（一）

---免疫細(xì)胞的分離、細(xì)胞涂片、固定及保存【原理】T細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的，不均一的整體，根據(jù)其發(fā)育的不同階段，表面標(biāo)記以及功能，可將其分為不同的亞群。T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且對(duì)B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答起到輔助和調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)，有助于了解機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，對(duì)免疫缺陷病、腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植排斥反應(yīng)等疾病的診斷、分型、預(yù)后和療效觀察有著重要的意義。外周血正常值CD3:60~80%；CD4:35~55%；CD8:20%~30%CD4/CD8:約1.4~2.0CD4/CD8＜1.4：①免疫缺陷病，如艾滋病≤0.5；②惡性腫瘤；③再生障礙性貧血；④某些病毒感染。CD4/CD8＞2.0：①自身免疫性疾病，如SLE、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。SABC-AP法測(cè)定T細(xì)胞亞群SABC：鏈酶親和素－生物素鏈酶親和素：一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子結(jié)合。親和素與生物素一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定，形成一種類(lèi)似晶格的復(fù)合體。AP：堿性磷酸酶。酶標(biāo)生物素+親合素A+B間接SABC-AP法

----T細(xì)胞亞群檢測(cè)

淋巴細(xì)胞＋小鼠抗人CD3/CD4/CD8分子單克隆抗體（一抗）二抗（生物素化）標(biāo)有AP的SABC酶底物顯色劑（BCIP/NBT）酶將底物催化顯色，陽(yáng)性細(xì)胞膜上顯色。此為間接法。直接法：不用二抗，將SABC物直接標(biāo)記于一抗。（一抗價(jià)格昂貴）SABC系統(tǒng)對(duì)抗原抗體反應(yīng)起到放大作用，提高反應(yīng)的敏感性?！緦?shí)驗(yàn)材料】肝素、淋巴細(xì)胞分層液、Hank’s液、PBS等；一次性注射器、試管、滴管、離心機(jī)、微量移液器、玻片、顯微鏡，溫箱等。鼠抗人CD3、CD4、CD8單克隆抗體（一抗）；羊抗鼠IgG（生物素化二抗）；SABC-AP；底物（BCIP/NBT磷酸甲苯胺藍(lán)鹽）等。1、標(biāo)本制備：淋巴細(xì)胞懸液的制備（1）取肝素抗凝血5ml與5mlHank’s液稀釋混勻，每組取2ml，用滴管貼管壁輕輕疊加于2ml淋巴細(xì)胞分層液上，配平后1500rpm離心10mins。（2）洗滌細(xì)胞：用滴管仔細(xì)吸出位于血漿和分離液之間乳白色的淋巴細(xì)胞，（滴管吸之前先排除空氣，防止分層；滴管轉(zhuǎn)動(dòng)一圈確保都吸完）放入盛有2mlPBS液的試管（吹打目的洗細(xì)胞表面雜質(zhì)，暴露表面分子），1500rpm離心10mins，棄上清（直接倒一次），將沉淀的淋巴細(xì)胞輕彈混勻后加入PBS液洗滌，1500rpm離心5mins；加入2ml重復(fù)洗滌一次。（3）棄上清，淋巴細(xì)胞沉淀用200μl以上PBS溶解，取20μl細(xì)胞涂片，下一次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T細(xì)胞亞群用。2、標(biāo)本染色細(xì)胞涂片用記號(hào)筆劃圈，滴固定液1滴，室溫固定2~3min（已做）滴加鼠抗人CD3、CD4、CD8抗體15μL，輕輕搖晃，使單抗均勻鋪在細(xì)胞表面，37℃孵育2~3h（使Ag-Ab結(jié)合），PBS洗3次（洗掉沒(méi)結(jié)合的一抗）。滴加生物素標(biāo)記羊抗小鼠抗體15μL，37℃孵育30~45min，PBS洗3次。滴加SABC15μL，37℃孵育30~45min，PBS洗3次（洗掉沒(méi)結(jié)和的二抗）。滴加顯色劑30~50μL，室溫顯色20~40min?？稍陲@微鏡下觀察，待細(xì)胞膜上出現(xiàn)紅色標(biāo)記物時(shí)，用PBS淋洗。滴加細(xì)胞核復(fù)染液1滴，30秒后自來(lái)水淋洗。顯微鏡下觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果觀察】高倍鏡下計(jì)數(shù)100～200個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。計(jì)算陽(yáng)性率。

陽(yáng)性細(xì)胞：細(xì)胞表面呈紅色。

①標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性：細(xì)胞表面呈紅色，可見(jiàn)深藍(lán)色細(xì)胞核；

②強(qiáng)陽(yáng)性：細(xì)胞周緣及中央均呈紅色，看不見(jiàn)細(xì)胞核；

③弱陽(yáng)性：細(xì)胞表面呈淡紅色，可見(jiàn)淡蘭色細(xì)胞核；

④陰性細(xì)胞：細(xì)胞表面無(wú)著色反應(yīng)，呈淡蘭色?！咀⒁馐马?xiàng)】為防止污染試劑，加樣器吸頭最好為一次性使用。分離單個(gè)核細(xì)胞中，將稀釋血液加于分層液上時(shí)，務(wù)必要使之形成良好的界面，否則影響分離結(jié)果。孵育過(guò)程中，應(yīng)將涂片置于濕盒中，操作中始終要注意保持涂片的濕潤(rùn)，以確保得到完美的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。淋洗時(shí)不要直接對(duì)著細(xì)胞沖，避免細(xì)胞脫落。淋洗后，加試劑前須擦干細(xì)胞圈外水分，以免試劑流散。小鼠拉脫頸椎處死，用碘酒、酒精消毒皮毛。剪開(kāi)皮膚，打開(kāi)腹腔。（小鼠趴著，脾位于左側(cè)）找到紅色的脾臟，用鑷子分離后摘除。將脾臟放入盛有5-10ml培養(yǎng)液的平皿中輕輕漂洗，并細(xì)心剝除周?chē)慕Y(jié)締組織。將脾臟移入另一個(gè)盛有5-10ml培養(yǎng)液的平皿中，輕輕漂洗后置于100目細(xì)胞篩中，輕輕擠壓使脾細(xì)胞通過(guò)篩孔進(jìn)