酶分子化學修飾課件

第四章酶分子的修飾

第二節(jié)酶化學修飾的種類及應(yīng)用

一、酶的表面化學修飾

（一）大分子修飾（大分子結(jié)合修飾）

是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。

1.定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。2.修飾劑：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與酶分子共價結(jié)合。（二）小分子修飾

（酶蛋白側(cè)鏈基團修飾）1概念定義：通過選擇性的試劑或親和標記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團發(fā)生化學反應(yīng)。側(cè)鏈基團：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團修飾劑：采用的各種小分子化合物。

20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。根據(jù)氨基酸側(cè)鏈R基的極性，20種氨基酸可分成4類。

①非極性R基氨基酸（共8種）：丙氨酸(Alanine,Ala,A),亮氨酸(Leucine,Leu,L),纈氨酸(Valine,Val,V)),

異亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),色氨酸(Tryptophan,Trp,W),甲硫氨酸(Methionine,Met,M),脯氨酸(Proline,Pro,P)②無電荷的極性R基氨基酸（共7種）：絲氨酸(Serine,Ser,S),蘇氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),

谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)③帶正電荷的極性R基氨基酸（共3種）：賴氨酸(Lysine,Lys,K),精氨酸(Arginine,Arg,R),組氨酸(Histidine,His,H)④帶負電荷的極性R基氨基酸（共2種）：天冬氨酸(Asparticacid,Asp,D),谷氨酸(Glutamicacid,Glu,E)小分子修飾的幾種重要反應(yīng)：烷基化反應(yīng)酰化反應(yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)烷基化反應(yīng)

2)?；磻?yīng)

試劑特點：含有結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團上的

親核基團，使之酰基化。

可作用基團：氨基，巰基，醇羥基（Ser絲、Thr蘇），酚羥基（Tyr絡(luò)）

3)氧化還原反應(yīng)試劑特點：具有氧化或還原性。

氧化劑：H2O2，N-溴代琥珀酰亞胺可被氧化的側(cè)鏈基團：巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。

還原劑：2－巰基乙醇、DTT等?？杀贿€原的側(cè)鏈基團：二硫鍵。連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護巰基。

4)芳香環(huán)取代反應(yīng)試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。碘代：

I2＋+HI

硝化：(NO2)4C++(NO2)3CH

（四硝基甲烷）2，4－二硝基氟苯碘乙酸三硝基苯磺酸

2)羧基的化學修飾修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸?？啥繙y定酶分子中羧基的數(shù)目。

+

水溶性碳化二亞胺3)胍基的化學修飾來源：Arg精修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰Tang=co基對氨基?；Ｐ揎梽?/p>

丁二酮二羰基化合物1，2－環(huán)己二酮苯乙二醛4)巰基的化學修飾來源：Cys半光修飾反應(yīng):烷基化修飾劑：碘乙酸(IAA)碘乙酰胺(IAM)

E-SH+R-X－>E-SR+HXN-乙基馬來酰亞胺（NEM）（常用的專一修飾巰基試劑）

E－SH＋

5)二硫鍵的化學修飾還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）氧化：過甲酸:7）酚羥基的化學修飾來源：Tyr酪修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）8）吲哚基的化學修飾來源：Trp色修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng)修飾劑：N-溴代琥珀酰亞胺（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法）用雙功能基團試劑(如戊二醛)，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。（四）固定化修飾（共價偶聯(lián)法）通過酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的最適pH、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。二、酶分子內(nèi)部修飾（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）

蛋白主鏈修飾采用酶法（用專一性較強的蛋白酶或肽酶為修飾劑）。

（與前面化學修飾區(qū)別）

酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準確的催化部位，酶活力提高。后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進行，稱肽鏈有限水解。應(yīng)用實例：1）提高酶活力：2）消除抗原性：（二）氨基酸置換修飾將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象