實驗九底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響

實驗九底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響第1頁，共13頁，2023年，2月20日，星期六實驗?zāi)康?/p>

1了解底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響。

2學(xué)習(xí)測定米氏常數(shù)的原理和方法。

第2頁，共13頁，2023年，2月20日，星期六實驗原理1913年，Michaelis和Menten提出了酶促反應(yīng)速度和底物濃度的關(guān)系式，即米氏方程。

υ＝V×[S]/(Km+[S])式中：

υ為反應(yīng)初速度

V為最大反應(yīng)速度

[S]為底物濃度

Km為米氏常數(shù)Km值是酶的一個特征性常數(shù)，可近似表示酶與底物的親和力。Lineweaver-Burk作圖法是用實驗方法測定Km值的最常用的方法。第3頁，共13頁，2023年，2月20日，星期六Lineweaver–Burk的作圖法—雙倒數(shù)作圖法。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常數(shù)Km的測定第4頁，共13頁，2023年，2月20日，星期六實驗時選擇不同的[S]，測定相對應(yīng)的υ。求出兩者的倒數(shù)，以1/υ對1/[S]作圖，則得到一個斜率為Km/V的直線。將直線外推與橫軸相交，其橫軸截矩為：－1/[S]＝1/Km，由此求出Km值。該法比較簡便。本實驗以胰蛋白酶消化酪蛋白為例，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測定Km值。胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)中堿性氨基酸（L－精氨酸和L－賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵水解。水解時生成自由氨基酸，故可用甲醛滴定法判斷自由氨基增加的數(shù)量來追蹤反應(yīng)。第5頁，共13頁，2023年，2月20日，星期六甲醛滴定法由于氨基酸分子在溶液中主要是兩性離子，故不能用酸、堿滴定其含量。但氨基酸的氨基可與甲醛反應(yīng)生成羥甲基和二羥甲基氨基酸，使上述平衡向右移動，促使氨基酸分子上的一NH3十基解離釋放出H+，從而使溶液酸性增加，就可以酚酞作指示劑用NaOH來滴定。第6頁，共13頁，2023年，2月20日，星期六小知識點：酚酞是堿性指示劑（變色范圍是堿性），酸滴堿時用堿性指示劑；反之堿滴酸時用酸性指示劑比如甲基橙甲基紅。第7頁，共13頁，2023年，2月20日，星期六三、器材錐形瓶滴定管移液管水浴鍋量筒等四、試劑與材料1.酪蛋白2.胰蛋白酶3.甲醛4.酚酞5.氫氧化鈉第8頁，共13頁，2023年，2月20日，星期六五、操作分別向6個小錐形瓶中加入5mL甲醛溶液和1滴酚酞，并滴加0.1mol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液，直至混合物呈微粉紅色。注意：每個錐形瓶中的顏色應(yīng)一致。取100mL酪蛋白溶液，加入另一錐形瓶中，在37℃水浴中保溫10分鐘。將胰蛋白酶也在37℃水浴中保溫10分鐘。然后精確量取10mL酶液加到酪蛋白溶液中（同時計時）。

第9頁，共13頁，2023年，2月20日，星期六充分混合后，隨即取出10mL反應(yīng)混合物（作為零時的樣品）吹至一含甲醛的錐形瓶中。用0.1mol/LNaOH溶液滴定，直至混合物呈微粉紅色，記下所用0.1mol/LNaOH溶液的mL數(shù)。第10頁，共13頁，2023年，2月20日，星期六在2、4、6、8和10分鐘時，分別取出10mL消化樣品，準(zhǔn)確照上法操作。注意：在每個樣品中滴定終點的顏色應(yīng)當(dāng)一致。用增加的滴定度對時間作圖，測定初速度。配制不同濃度的酪蛋白溶液（7.5、10、15、20、30g/L）測定不同底物濃度時的活力。用實驗測得的結(jié)果，以以1/υ對1/[S]作圖，求出V和Km的數(shù)值。

第11頁，共13頁，2023年，2月20日，星期六【注意事項】1．實驗表明，反應(yīng)速度只在最初一段時間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時間的延長，酶促反應(yīng)速度逐漸下降。原因有多種，如底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加而對酶產(chǎn)生抑制作用并加速逆反應(yīng)的進(jìn)行，酶在一定pH及溫度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反應(yīng)的初速度為準(zhǔn)。2．本實驗是一個定量測定方法，為獲得準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，應(yīng)盡量減少實驗操作中帶來的誤差。因此配制各種底物溶液時應(yīng)用同一母液進(jìn)行稀釋，保證底物濃度的準(zhǔn)確性。各種試劑的加量也應(yīng)準(zhǔn)確，并嚴(yán)格控制準(zhǔn)確的酶