兔出血癥病毒遺傳變異分析及RT-PCR檢測(cè)的方法建立

兔出血癥病毒遺傳變異分析及RT-PCR檢測(cè)的方法建立兔出血癥病毒(RabbitHemorrhagicDiseaseVirus,RHDV)是一種高傳染性的兔科病毒，在兔科動(dòng)物中引起嚴(yán)重的傳染病。近年來(lái)，隨著病毒的逐漸變異，使得傳染能力和病原性逐漸增強(qiáng)，RHD疫情頻發(fā)，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)及兔產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)RHDV的變異及快速檢測(cè)方法的研究變得尤為重要。本文通過(guò)對(duì)RHDV的遺傳變異分析，建立適用于RHDV檢測(cè)的RT-PCR方法。一、RHDV遺傳變異分析RHDV病毒基因組長(zhǎng)度約為7.5kb，分為五個(gè)開放閱讀框(ORF)。通過(guò)對(duì)多個(gè)RHDV菌株的比較分析，研究發(fā)現(xiàn)RHDV存在較為廣泛的遺傳變異，其中主要集中在第三個(gè)ORF。該區(qū)域包含了衣殼蛋白VP60的編碼基因，VP60是病毒的外殼蛋白，與病毒的抗原性密切相關(guān)。因此，該區(qū)域病毒的變異會(huì)對(duì)病毒的致病力以及病毒的抗原性產(chǎn)生影響。二、RT-PCR檢測(cè)方法的建立1.試劑制備1）RHDV特異性引物和探針根據(jù)VP60基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)PCR引物，引物一為VP60-F(5'-ATCACGATTCTGGGAAGACC-3')和VP60-R(5'-CCACTGTCTACTACCAGGTTG-3')，引物二為VP60-F(5'-GCACTGGTGACTGGGTAGAC-3')和VP60-R(5'-GCTCATGTTGGTGCTGAGTA-3')，同時(shí)設(shè)計(jì)RHDV的特異性探針VP60-P(5'-FAM-CTGTTGTACTGGTGCTGGGCCAAATGC-Tamra-3')。引物和探針的合成均由生物技術(shù)公司進(jìn)行。2）其他試劑瓊脂糖、Tris-HCl緩沖液、EDTA、Trizol、RNase-free水、反轉(zhuǎn)錄酶套裝、DNA聚合酶、dNTPs混合物、MgCl2、10×PCRBuffer、TA純化試劑盒。2.RNA提取和反轉(zhuǎn)錄從疑似RHDV感染兔的組織中提取RNA，一般可采用Trizol法或其他RNA提取試劑盒。依據(jù)反轉(zhuǎn)錄酶套裝說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將提取到的RNA加入反應(yīng)管中，在45°C下反應(yīng)需30min。3.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系設(shè)置如下：10×PCRbuffer2.5μL，MgCl22.0μL，dNTPs混合物0.5μL，引物1/引物20.5μL，Taq酶0.25μL，模板cDNA2μL，ddH2O上調(diào)至總體積25μL。以下是PCR程序：95°C預(yù)變性5min95°C變性30s58°C退火30s72°C延伸20s共循環(huán)30次72°C最終延伸7min4.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物分析將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產(chǎn)物的大小和純度。電泳結(jié)束后，將凝膠中的RHDV特異性條帶進(jìn)行切取，用TA純化試劑盒進(jìn)行純化。5.實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)按照實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光PCR程序能同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，通過(guò)擴(kuò)增病毒的核酸以及RHDV特異性探針的熒光信號(hào)，監(jiān)控病毒含量的變化。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果RHDV特異性引物擴(kuò)增出明顯的低甲基琥珀酸酯條帶，條帶大小約為280bp。2.實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果表明，可以檢測(cè)到RHDV的核酸，對(duì)RHDV菌株的檢測(cè)靈敏度高，并且沒(méi)有交叉反應(yīng)。四、結(jié)論通過(guò)對(duì)RHDV的遺傳變異分析，可了解病毒的變異情況以及變異區(qū)域。同時(shí)，建立的RT-PCR檢測(cè)方法，具有