微生物限度檢查解讀

微生物限度檢查解讀第1頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六一、前言1.規(guī)定了微生物限度檢查的定義及檢查內(nèi)容。2.實(shí)驗(yàn)的環(huán)境設(shè)施及操作的無菌要求。3.對檢查中使用的助溶劑、中和劑、滅活劑的作用及對微生物生長和存活的影響應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證4.霉菌培養(yǎng)溫度改為23~28℃，控制菌培養(yǎng)溫度改為以35~37℃表示，細(xì)菌不變。5.增加檢驗(yàn)結(jié)果的單位：10g，10ml。第2頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六二、具體內(nèi)容1.檢驗(yàn)量：指明了檢驗(yàn)量是一次試驗(yàn)所用的量；對貴重藥、微量包裝藥可酌減，但不規(guī)定3g或5g；因沙門菌檢查的報(bào)告單位為10g或10ml，所以檢驗(yàn)量應(yīng)另增10g或10ml（不含陽性對照用量）。第3頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六2.供試液制備（與2000年版藥典相比的不同點(diǎn)）2000年版藥典2005年版藥典（1）使用0.9%無菌NaCl溶液使用pH7.0無菌NaCl-蛋白胨緩沖液（2）供試液制備以加一定體積表示供試液制備以加至一定體積表示（3）供試液分三類六種供試液分三類七種，但分類更合理，函蓋面更全（4）制備方法有限增加了新的制備方法，對培養(yǎng)基稀釋作了進(jìn)一步詳細(xì)規(guī)定第4頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六3.細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)3.1平皿法：3.1.1平皿法兩版藥典比較3.1.2平皿法菌數(shù)報(bào)告規(guī)則

3.1.3平皿法其他內(nèi)容，如陰性對照試驗(yàn)等等與2000年版相同第5頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六3.細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)（續(xù)）3.2薄膜過濾法(為2005年版藥典新增內(nèi)容)3.2.1操作3.2.2陰性對照試驗(yàn)3.2.3培養(yǎng)和計(jì)數(shù)3.2.4菌數(shù)報(bào)告規(guī)則

第6頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六3.1.1平皿法兩版藥典比較2000年版藥典2005年版藥典（1）連續(xù)3個稀釋級連續(xù)2~3個稀釋級（2）培養(yǎng)基約15ml培養(yǎng)基約15~20ml（3）每稀釋級應(yīng)作2~3個平皿每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平皿（4）無培養(yǎng)和計(jì)數(shù)欄增加對同級的兩個平板，當(dāng)菌落數(shù)大于等于15個時，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或1倍以上第7頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六3.1.1平皿法兩版藥典比較（續(xù)）2000年版藥典2005年版藥典（5）培養(yǎng)基的適用范圍，規(guī)定比較亂，表達(dá)不清，不易理解營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅瓊脂培養(yǎng)基用于進(jìn)行霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于進(jìn)行酵母菌計(jì)數(shù),或用于特殊品種（含蜂蜜、王漿的液體制劑）進(jìn)行酵母菌計(jì)數(shù)第8頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六3.1.2平皿法菌數(shù)報(bào)告規(guī)則

2000年版藥典存在許多不足，2005年版作了較大改動1)規(guī)定取兩位有效數(shù)字報(bào)告。在計(jì)數(shù)及中間計(jì)算過程中可多保留一位。2)2005年版中：（1）與2000版相同第9頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六3.1.2平皿法菌數(shù)報(bào)告規(guī)則

(續(xù))（2）當(dāng)比值≤2時，與2000年版相同，以兩級均數(shù)報(bào)告當(dāng)比值>2時，規(guī)則與2000年版不同，如比值為2~5時，說明兩級之間存在較大差別，應(yīng)以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)增加了比值大于5，或出現(xiàn)高稀釋級菌數(shù)大于或等于低稀釋級，應(yīng)查明原因。如試液有較強(qiáng)的抑菌作用，就不能象上述一樣忽略，必須調(diào)整方法第10頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六3.1.2平皿法菌數(shù)報(bào)告規(guī)則(續(xù))

（3）與2000年版相同（4）與2000年版相同第11頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六3.1.2平皿法菌數(shù)報(bào)告規(guī)則(續(xù))

3)還刪除了2000年版中不合理的3條;把培養(yǎng)基稀釋列為具抑菌活性供試品在任何情況下通用的方法，不僅僅局限于某種情況,而且方法也進(jìn)行了合理的調(diào)整，取樣改為2ml，每1ml所注平皿多個(不定)第12頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六3.2薄膜過濾法

(為2005年版藥典新增內(nèi)容)3.2.1操作：1）取相當(dāng)于供試品1g（ml）的供試液[如取供試品1g（ml）或1：10供試液10ml或1：100供試液100ml]，加至適量稀釋劑，混勻，過濾2）沖洗方法、沖洗液、沖洗量（應(yīng)驗(yàn)證）3）每種培養(yǎng)基至少制備一張膜

第13頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六3.2薄膜過濾法(續(xù))3.2.2陰性對照試驗(yàn):

等同于“空白試驗(yàn)”，即不加供試品，按同法操作所得結(jié)果，每種培養(yǎng)基均需做。第14頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六3.2薄膜過濾法(續(xù))3.2.3培養(yǎng)和計(jì)數(shù):

與平皿法相同。但每張濾膜上菌數(shù)應(yīng)不得過100個，如果超過100個，也就是每1g（ml）供試品含菌量較多，可取適宜稀釋級供試品1ml檢查，例如，1：10取10ml檢查，菌落150個（150個/g），則改用1：10取1ml檢查，菌落為15個（150個/g）第15頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六3.2薄膜過濾法(續(xù))3.2.4菌數(shù)報(bào)告規(guī)則:1)報(bào)告每1g（ml）供試品菌落數(shù)；2)若膜上無菌落生長時，如果（每張膜過濾1g(ml)供試品或1：10×10ml供試液，如每張膜過濾1：10×10ml供試液，則報(bào)告<10個，依此類推，為<1乘以稀釋倍數(shù)第16頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六4.控制菌檢查1)大腸菌基本相同，主要修改是：當(dāng)MUG和靛基質(zhì)兩項(xiàng)中有一項(xiàng)為陽性時，大腸菌的進(jìn)一步確認(rèn)通過大腸菌菌落形態(tài)特征比較進(jìn)行鑒別排除，增加大腸菌形態(tài)特征，對進(jìn)一步確認(rèn)做什么生化試驗(yàn)不作硬性規(guī)定（是否妥？），所以原有的生化試驗(yàn)結(jié)果判斷刪除了。第17頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六4.控制菌檢查(續(xù))2)增加大腸菌群檢查。3)沙門、金葡、綠膿也和大腸菌一樣作了調(diào)整，大同小異。沙門菌規(guī)定取供試品10g（ml），另加陽性對照10g（ml）。4)增加了梭菌檢查（無論試管或平皿都要注意厭氧條件培養(yǎng)）。第18頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六5.微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（略）主要變化是由按劑型控制改為按給藥途徑控制。

第19頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六6.方法驗(yàn)證6.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證：1)菌液制備（略）2)驗(yàn)證方法：主要分四組，測得四組數(shù)據(jù)。①供試品對照組：按擬定的菌落計(jì)數(shù)方法，準(zhǔn)確測定規(guī)定量(與試驗(yàn)組的相同)的供試液中的菌落數(shù)，得供試品的已知含菌數(shù)----相當(dāng)于已知供試品的含量。②菌液組：測定所加的試驗(yàn)菌的菌數(shù)----相當(dāng)于精密稱定對照品，得對照品的已知加入量。第20頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六6.方法驗(yàn)證(續(xù))③試驗(yàn)組（操作略）：取已知含菌數(shù)的供試液（試驗(yàn)可能用的最低稀釋級供試液1ml）和一定量的試驗(yàn)菌，進(jìn)行測定。測得試驗(yàn)組的總菌量，測定兩份（兩個平皿），求平均值計(jì)算試驗(yàn)組的回收率：試驗(yàn)組-供試品對照組（加入試驗(yàn)菌的測定值）菌液組（加入試驗(yàn)菌的已知值）

（應(yīng)≥70%）第21頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六6.方法驗(yàn)證(續(xù))④稀釋劑對照組：以相應(yīng)稀釋液替代供試品，按③試驗(yàn)組同法測定計(jì)算稀釋劑對照組的回收率：稀釋劑對照組（加入試驗(yàn)菌的測定值）菌液組（加入試驗(yàn)菌的已知值）

（應(yīng)≥70%）第22頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

上述整個試驗(yàn)應(yīng)至少進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，即分別平行取來自同一批樣品的三份供試品，平行操作，作三次驗(yàn)證測定。每次驗(yàn)證試驗(yàn)的試驗(yàn)組和稀釋對照組回收率必須兩項(xiàng)同時≥70%，所被驗(yàn)證的檢查法成立，否則……第23頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六6.2控制菌的驗(yàn)證

根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌，進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證；根據(jù)檢查的控制菌選擇對應(yīng)的驗(yàn)證菌，大腸菌群選大腸埃希菌。試驗(yàn)分二組第24頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

①試驗(yàn)組（操作略）：規(guī)定量一般為1：10供試液10ml（相當(dāng)于1g或1ml供試品），沙門菌除外。取供試液、試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中。按擬定方法檢查。第25頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

②陰性菌對照組：檢查大腸、大腸菌群、沙門----金葡為陰性檢查綠膿、金葡、梭菌----大腸為陰性進(jìn)行陰性試驗(yàn)時，取供試液及陰性對照菌，然后按控制菌檢查的方法進(jìn)行試驗(yàn)，例如，驗(yàn)證控制菌大腸菌的檢查方法時，應(yīng)取供試液及金葡菌，按大腸菌檢查方法進(jìn)行增菌檢查，應(yīng)不得檢出金葡菌。本陰性菌對照組試驗(yàn)的目的是為了驗(yàn)證大腸菌檢查方法的專屬性第26頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六7.總結(jié)

作為研發(fā)者，需要做的工作是：(1)．建立方法；(2)．驗(yàn)證方法；(3)．制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

作為檢驗(yàn)者，應(yīng)該做的工作是：

--按制訂的方法（質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)）檢驗(yàn)

第27頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六10號資料（質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究資料）(1)實(shí)驗(yàn)儀器、試藥（包括培養(yǎng)基、稀釋液、沖洗液、菌液……，包括培養(yǎng)基的相關(guān)試驗(yàn)）(2)根據(jù)什么原因、理由、依據(jù)擬定的方法第28頁，共31頁，2023年，2月20日，星期六

(3)按藥典要求進(jìn)行驗(yàn)證，主要實(shí)驗(yàn)操作(4)驗(yàn)證數(shù)據(jù)、結(jié)果，列表表示(5)得出結(jié)論第