國家自然基金標(biāo)書-終稿

報告正文（一）（0字：1、項目的立項依據(jù)隨著機(jī)械通氣、表面活性物質(zhì)替代療法等新技術(shù)應(yīng)用，危重新生兒、尤其是早產(chǎn)兒存活率已顯著提高。然而，長時間吸入高濃度氧，幸存者易發(fā)生肺部氧化應(yīng)激損傷。目前，高氧肺損NICU確切機(jī)制尚未完全闡明，更無有效的防治手段。因此深入研究其發(fā)病機(jī)制，積極防治高氧肺損傷，具有優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)的戰(zhàn)略意義。高氧肺損傷是一個涉及許多細(xì)胞活動的復(fù)雜過程，可分為早期的組織損傷（彌散性肺泡炎）和晚期的損傷后修復(fù)（肺間質(zhì)重構(gòu)）xtracellularmatrix,C的重建參與了高氧肺損傷的整個病理過程，若ECMECMECM重建是關(guān)系高氧肺損傷結(jié)局的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗室在國內(nèi)外率先開展了對早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷中基質(zhì)金屬蛋白酶matrixmetalloproteinsMP(tissuinhibitoofmetalloproteinases,TIPMMPsMMPs/TIMPsECM[1]（具體研究成果見研究基礎(chǔ)欄。MMPsECM引起MMPsMMPsxtracellularmatrixmetalloproteinaseinducer,EmrnMMPsEmmprin58KDEmmprin[2]。目前，少數(shù)文獻(xiàn)已證明，體外Emmprin與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后，成纖維細(xì)胞MMPsEmmprinMMPMAPKp38ECM3，4]Emmprin/MAPKp38MMPsECMMMPs/TIMPs目前國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報道。轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforminggrowthfactorbeta,TGF-β）在下調(diào)MMPs表達(dá)中起關(guān)TGF-βMMPs[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β抑MMP-1MMP-1[6MMP-1SMADECM[5TGF-β/SMADMMPs/TIMPsECMECMMMPs/TIMPs近年來對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，位于大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)膜上約50-100nmcaveolae，是許多信號分子完成跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的“驛站”。小窩蛋白（caveolin）是小窩胞漿面包被的一種21-24kD的膜蛋白，是許多信號分子活性狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)者。在無胞caveolin通常與富集于小窩質(zhì)膜上的各種信號分子、受體及非受體型酪氨酸激caveolin分子構(gòu)象發(fā)生變構(gòu)或共價修飾，調(diào)節(jié)信號物質(zhì)的活化狀態(tài)，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控[7]。有關(guān)caveolin在肺ECMΙcaveolincaveolin-1caveolin-1α[8–1TGF-βⅠ型受體（TβRⅠ）TGF-βSMAD-2[9]。Emmprin具有酪氨酸蛋白激酶活性，且其信號傳導(dǎo)為酪氨酸磷酸化依賴的MAPKp38caveolinEmmprinEmmprinMAPK和下游分子的磷酸化。簡圖如下：胞外信 caveolin +? caveolin/Emmprin作用 Emmprin/MAPK號刺激 變構(gòu)活化 + caveolin/TβRⅠ作用 信號整合 調(diào)控肺ECM重建基于上述，申請者提出如下假設(shè)：⑴高氧暴露下MMP抑制劑失衡是高氧肺損傷MMPsEmmprin/MAPKTGF-β/SMADMMPs，ECM本人所在的研究室屬呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗室。多年來，本人一直致力于新生兒高氧慢性肺損傷的研究，已成功建立了早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷的動物模型、掌握了支氣管肺泡灌洗術(shù)、體外Ⅱ型肺MMPs/TIMPs失衡等因素在高氧肺損傷發(fā)病機(jī)制中所起的作用進(jìn)行了較深入的研究，同時應(yīng)用地塞EGb761（見研究基礎(chǔ)欄這些理論研究和技術(shù)方法的積累為本課題的開展奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。本研究如能完成，可望為探索高氧肺損傷后肺ECM參考文獻(xiàn)TaylorPM,WoodfieldRJ,HodgkinMNetal.Breastcancercell-derivedEMMPRINstimulatesfibroblastMMP2releasethroughaphospholipaseA(2)and5-lipoxygenasecatalyzedpathway.Oncogene2002Aug22;21(37):5765-72LiangL,MajorT,BocanT.Characterizationofthepromoterofhumanextracellularmatrixmetalloproteinaseinducer(EMMPRIN).Gene2002Jan9;282(1-2):75-86LimM,MartineT,JablonsD.Tumor-derivedEMMPRIN(extrocellularmatrixmetalloproteinasesinducer)stimulatescollagenasetranscriptionthroughMAPKFEBSLett1998;441(1):88~92YuanW,VargaJ.Transforminggrowthfactor-betarepressionofmatrixmetalloproteinase-1indermalfibroblastsinvolvesSmad3.JBiol2001;276(42):38502-10WhiteLA,MitchellTI,BrinckerhoffCE.Transforminggrowthfactorbetainhibitoryelementintherabbitmatrixmetalloproteinase-1(collagenase-1)genefunctionsarepressorofconstitutivetranscription.BiochimBiophysActa2000Feb29;1490(3):259-68RazaniB,ZhangXL,BitzerM,etal.Caveolin-1regulatesTGF-beta/SMADsignalingthroughaninteractionwiththeTGF-betatypeIreceptor.JBiolChem2001;276(9):6727~6738RamirezMI,PollackL,MillienG,etal.Thealpha-IsoformofCaveolin-1IsaMarkerofVasculogenesisinEarlyLungDevelopment.JHistochemCytochem2002;50(1):33~42DrabM,VerkadeP,ElgerM,etal.Lossofcaveolae,vasculardysfunction,andpulmonarydefectsincaveolin-1gene-disruptedmice.Science2001;293(5539):2449~522、研究目標(biāo)：EmmprinTGF-βMMPs增加，ECMEmmprin/MAPK的影響，為高氧肺損傷發(fā)生機(jī)制和尋找有效防治措施提供理論依據(jù)。研究內(nèi)容：Emmprin/MAPKp38ECM①研究高氧肺損傷不同時間點(diǎn)肺組織中Emmprin、P38、磷酸化P38的表達(dá)。②研究高氧肺損傷Emmprin/MAPKp38信號通路活化狀態(tài)與MMPs表達(dá)雙變量關(guān)系。ECM：①研究高氧肺損傷不同時間點(diǎn)肺組織中TGF-β、TβRΙ、SMAD、磷酸化SMAD的表達(dá)。②研究高氧肺損傷TβRΙ的激酶活性，計算磷酸化SMAD與非磷酸化SMAD比值。③研究高氧肺損傷TGF-β/SMAD信號通路的活化狀態(tài)與MMPs/TIMPs的雙變量關(guān)系。caveolin-1Emmprin/MAPKp38ECM：①研究高氧肺損傷不同時間點(diǎn)肺組織中caveolin-1表達(dá)及酪氨酸磷酸化水平。②研究高氧肺損傷肺組織質(zhì)膜小窩內(nèi)caveolin-1與Emmprin的共定位。③研究高氧肺損傷肺組織質(zhì)膜小窩內(nèi)caveolin-1與TβRΙ的共定位。擬解決的關(guān)鍵問題：制備方面已積累了豐富經(jīng)驗，能成功完成此模型的復(fù)制。本研究假設(shè)caveolin與Emmprin的相互作用可調(diào)控Emmprin/MAPKp38信號通路活化；caveolin-1TβRΙ的相互作用可調(diào)控TGF-β/SMAD未能從形態(tài)學(xué)上直接證實(shí)。借助共聚焦顯微鏡觀察和熒光雙重標(biāo)記技術(shù)可解決這一技術(shù)難題。3、擬采取的研究方案及可行性分析。研究方法：本課題采用共聚焦顯微鏡confocalmicroscop究方法，輔以蛋白質(zhì)與核酸分析技術(shù)WesternBlo、NorthernBlot方法，檢測各指標(biāo)的動態(tài)變化，并對各指標(biāo)進(jìn)行定位、定性、定量分析。建立早產(chǎn)大鼠慢性高氧肺損傷模型：⑴.檢測caveolin-1酪氨酸磷酸化水平：① caveolin-1pAb② 應(yīng)用抗磷酸化酪氨酸mAbWesternBlot⑵.EmmprinP38P38SMAD-2、SMADECM① 蛋白質(zhì)水平檢測—Western。② mRNANorthernBlo（或RT-PC。⑶.檢測肺組織中TβRΙ的激酶活性：① TβRΙ分離提取—免疫沉淀法（immunoprecipition）② TβRΙGST-SMAD2（deCaestecher,M授提供）反應(yīng)，應(yīng)用免疫印跡法檢測磷酸化SMAD2水平，計算TβRΙ的激酶活性。⑷.檢測肺組織質(zhì)膜小窩內(nèi)caveolin/Emmprin及caveolin-1/TβRΙ的共定位及表達(dá)：①樣本制備：制備組織切片→加入抗caveolinmAb→PE標(biāo)記的二抗→加入抗Emmprin/TβRΙ的pAb→FITC標(biāo)記二抗（TCSSPLeicacaveolin表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量。⑸．應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法處理數(shù)據(jù)：早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷模型caveolaeSAS早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷模型caveolaecaveolin酪氨酸磷酸化狀態(tài)（免疫沉淀、免疫印跡）Emmprin/MAPKp38信號通路研究TGF-β/SMAD信號通路研究Emmprin、P38、磷酸化P38TGF-β、TβR、SMAD、磷酸化SMAD表達(dá)（免疫印跡與NorthernBlot表達(dá)（WesternBlotNorthernBlot）或RT-PCR)TβRⅠ激酶活性（免疫沉淀和免疫印跡）caveolin/Emprin共定位(caveolin/Emprin共定位(鏡)caveolin/TβRⅠ共定位(鏡)模型復(fù)制，蛋白、核酸分析等技術(shù)（詳見研究基礎(chǔ)欄）分試劑。新一代共聚焦顯微鏡具有觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的立體定位功能，用其檢測在體組織caveolin/Emmprin、caveolin/TβRⅠ信號分子在亞細(xì)胞位點(diǎn)的共定位表達(dá)，雖無文獻(xiàn)報道，caveolin-1在細(xì)胞質(zhì)膜上的定位表達(dá)也已獲成功。申請人所在單位的醫(yī)學(xué)中心的共聚焦顯微鏡和本實(shí)驗室的基本研究設(shè)備，能保證本實(shí)驗研究完成。4、本項目的特色與創(chuàng)新之處。理論上的創(chuàng)新：Emmprin/MAPKp38道。本課題研究caveolinEmmprin/MAPKTGF-β/SMAD發(fā)病機(jī)制開辟新的研究領(lǐng)域，并為其防治開拓新思路。方法上的創(chuàng)新：以在體組織為研究對象，應(yīng)用免疫熒光雙重標(biāo)記共聚焦顯微鏡技術(shù)研究caveolin/Emmprin、caveolin/TβRΙ共定位，國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報道，可望為深入研究小窩蛋白對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制開辟新途徑。5、年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果。年度研究計劃及預(yù)測進(jìn)展本課題研究內(nèi)容預(yù)計用3年時間完成.20041~820049~2005220053~7完成MMPs、TIMPs、TGF-β、TβRΙ、SMAD2及其mRNA20058~200512完成caveolin-1表達(dá)和caveolin-1/TβRΙ20061~20066完成caveolin-120067~12研究數(shù)據(jù)資料分析、總結(jié)、論文撰寫及成果鑒定。預(yù)期研究成果本項目所建立的早產(chǎn)新生大鼠慢性高氧肺損傷模型，不僅為本課題提供了研究對象，而且為研究高氧肺損傷后肺ECM重建提供了模型。MMP抑制劑失衡是高氧肺損傷MMPsEmmprin/MAPKp38TGF-β/SMADMMPs本研究內(nèi)容也可能為預(yù)防和干預(yù)高氧肺損傷提供理論依據(jù)。（二）研究基礎(chǔ)與工作條件1、 工作基礎(chǔ)1.與本項目有關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績本課題組多年來一直進(jìn)行高氧肺損傷的發(fā)病機(jī)制及防治的研究，做了許多基礎(chǔ)和臨床研究工作。已成功建立早產(chǎn)新生大鼠高濃度氧（85%～95%）急性肺損傷和慢性肺纖維化的模型；已完成肺組織中各種抗氧化酶活力、羥脯氨酸含量與肺纖維化的相關(guān)性研究；內(nèi)源性一氧化氮在高氧肺IL-8肺損傷肺組織中表達(dá)的研究；基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在高氧肺損傷中的作用機(jī)制的研究；及促紅細(xì)胞生成素、地塞米松、維甲酸對新生鼠高氧肺損傷的干預(yù)研究。獲獎?wù)n題目前正承擔(dān)的相關(guān)科研項目：1.2.相關(guān)研究工作發(fā)表的文章：附：基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在高氧肺損傷中的作用1.高氧組病理學(xué)改變 2.高氧組MMPs表達(dá)圖1肺發(fā)育不良，示肺泡 圖2細(xì)胞增生、間質(zhì)纖維 圖3MMP-2強(qiáng)陽性表數(shù)目減少、結(jié)構(gòu)簡單 化改變3.酶譜法測BALF中明膠酶活性 4.高氧暴露后MMPsTIMPs表達(dá)增加MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-23dO20.46±0.360.90±0.642.00±0.47 0.30±0.23air0.07±0.100.07±0.160.87±0.58 0.03±0.087dO21.33±0.600.1