課題3血紅蛋白的提取和分離

課題3 血紅蛋白的提取和分離一、學(xué)習(xí)目標(biāo)：本課題嘗試對(duì)血液中血紅蛋白的提取和分離， 使學(xué)生能夠體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法， 并了解色譜法，電泳法等分離生物大分子的基本原理， 為今后學(xué)習(xí)運(yùn)用這些技術(shù)打下基礎(chǔ)。二、重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法三、難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。第一課時(shí)【自主學(xué)習(xí)】閱讀教材，完成以下填空一、凝膠色譜法1、概念：根據(jù)被分離蛋白質(zhì)的 的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來進(jìn)行分離。2、原理（1）大多數(shù)凝膠是由 類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的 小球體，內(nèi)部有許多 。（2）當(dāng) 不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程 ，移動(dòng)速度 ，而相對(duì)分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 移動(dòng)，路程 ，移動(dòng)速度 ，從而使 不同的蛋白質(zhì)分子得以分離。二、緩沖溶液1、作用：在一定范圍內(nèi)，抵制 的 對(duì)溶液pH的影響，維持 pH 。2、配制：由 種緩沖劑溶解于 中配制而成，通過調(diào)節(jié)緩沖劑的 就可以得到不同 pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。【課堂探究】1、已知蛋白質(zhì)混合液在通過凝膠色譜法進(jìn)行分離時(shí)，被洗脫的先后順序依次是 A、B判斷下列敘述的正誤：（1）A的相對(duì)分子質(zhì)量比 B大1（2）B容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程 長移動(dòng)速度慢。（3）A容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程 長移動(dòng)速度快?！咀灾鲗W(xué)習(xí)】閱讀教材，完成以下填空三、電泳1、概念：指 在電場的作用下發(fā)生 的過程。2、原理：在一定的 下， 、 等生物大分子的可解離基團(tuán)會(huì)帶上或 ，在 的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷 的電極移動(dòng)。3、作用：電泳利用了待分離樣品中各種分子 的差異及分子本身的 、的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的 ，從而實(shí)現(xiàn)樣品中 的分離。4、方法：常用的電泳方法有 和 。測定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用 。5、蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶 以 及等因素。6、SDS的作用原理：SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生 。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在 SDS的作用下會(huì)解聚成 ，因此測定的結(jié)果只是 的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)— SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量 了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的 差別，使電泳遷移率完全取決于 ?！痉答佊?xùn)練】1、凝膠色譜分離法分離蛋白質(zhì)時(shí)，凝膠的種類較多，但其作用的共同點(diǎn)是 ( )A、改變蛋白質(zhì)分子通過凝膠時(shí)的路徑B、吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動(dòng)速度C、將酶或紐胞固定在凝膠中D、與蛋白質(zhì)分子進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而影響其移動(dòng)速度2.PCR技術(shù)可擴(kuò)增 DNA分子，電泳技術(shù)是將待測樣品放在光滑的凝膠薄膜上， 并加上直流電場， 可利用分子帶電荷不同分離和分析氨基酸和多核苷酸片段等有機(jī)物。 這兩項(xiàng)技術(shù)綜合應(yīng)用于現(xiàn)代刑偵， 可以獲得最可靠的證據(jù)。 如圖是一次尋找嫌犯的測試結(jié)果：圖申是把遺跡中含有 21個(gè)氨基酸的多肽進(jìn)行水解， 將氨基酸混合物進(jìn)行電泳的結(jié)果； 圖乙是通過提取罪犯 B遺跡DNA和四位嫌犯的 DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并采用特定限制酶處理后進(jìn)行電泳所得到的一組 DNA指紋圖譜。2(1)在同一電場下，由于蛋白質(zhì)或 DNA的 以及 、 不同而產(chǎn)生不同的遷移方向或速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品的分離。(2)在電泳過程中，帶電分子會(huì)向著 的電極移動(dòng)。(3)由圖甲得知，多肽由 種氨基酸組成；由圖乙可知 B最可能的對(duì)象是 。第二課時(shí)【自主學(xué)習(xí)】閱讀教材，完成以下填空四、實(shí)驗(yàn)操作1、樣品處理:通過 、 、 等操作收集血紅蛋白溶液。(1)紅細(xì)胞的洗滌：目的是 。分離時(shí)采取 ，直至上清液中沒有 ，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。(2)血紅蛋白的釋放：在 和 的作用下，紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：把 離心后，將試管中的液體用 過濾、除去，于 中靜置片刻后，分離出下層的 。2、粗分離：即透析(1)方法：將血紅蛋白溶液裝入 ，將 放入一定量適宜濃度的 中，透析 。(2)目的：將 的雜質(zhì)除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子物質(zhì)保留在袋內(nèi)。3、純化:通過凝膠色譜柱將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去。操作如下：(1)凝膠色譜柱的制作。(2)凝膠色譜柱的裝填①材料：本實(shí)驗(yàn)使用的是 。②方法：凝膠用 充分溶脹后。配成 ，一次性 倒人色譜柱內(nèi)。不能有 存在；不能發(fā)生 流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。(3)樣品的加入和洗脫①a、準(zhǔn)備：加樣前，打開流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的 緩慢下降到與 平齊，關(guān)閉出口。b、加樣：用 小心地將 1mL透析后的樣品加到 的頂端，注意不要破壞 。c、加樣后：打開下端出口，使樣品滲入 內(nèi)。3②洗脫：加入 ，打開下端出口，進(jìn)行 。4、純度鑒定：在鑒定的方法中，使用最多的是 。六、操作提示1、紅細(xì)胞的洗滌： 、 與 十分重要。 過少，無法除去血漿蛋白； 過高和 過長會(huì)使 等一同沉淀，達(dá)不到分離效果。2、色譜柱填料的處理： 商品凝膠使用前需直接放在 中膨脹，可以將加入其中的用 加熱，加速膨脹。3、凝膠色譜柱的裝填：在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在。氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的 ，降低 。4、蛋白質(zhì)的分離：如果紅色區(qū)帶 地移動(dòng)，說明色譜柱制作成功?！咎骄繗w納】一、人們用雞的紅細(xì)胞提取 DNA，而用人成熟的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么 ?二、洗滌紅細(xì)胞時(shí)為什么不能用蒸餾水代替生理鹽水 ?三、在血紅蛋白釋放過程中。加入蒸餾水和甲苯的目的是什么 ?四、凝膠色譜法的原理歸納【反饋訓(xùn)練】凝膠色譜技術(shù)是一種快速而又簡單的分離技術(shù)， 由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果， 目前已經(jīng)被生物化學(xué)、 分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且，已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答問題：（1）a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來的