紙層析法分離鑒定氨基酸

紙層析法分離鑒定氨基酸第1頁，共10頁，2023年，2月20日，星期六將樣品點在距濾紙一端約2～3cm的某一處，該點稱為原點；然后在密閉容器中層析溶劑沿濾紙的一個方向進行展層，這樣混合氨基酸在兩相中不斷分配。由于分配系數(shù)（Kd）不同，結(jié)果它們分布在濾紙的不同位置上。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置，可用比移值（Rf）來表示。所謂Rf，是指在紙層析中，從原點至氨基酸停留點（又稱為層析點）中心的距離（X）與原點至溶劑前沿的距離（Y）的比值。如圖第2頁，共10頁，2023年，2月20日，星期六第3頁，共10頁，2023年，2月20日，星期六在一定條件下（如溫度、展層劑的組成、層析紙質(zhì)量等不變），某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)，因此可作為定性依據(jù)。由于氨基酸無色，可利用茚三酮反應(yīng)使氨基酸層析斑點顯色，從而作定性分析。本實驗利用紙層析法分離氨基酸。

第4頁，共10頁，2023年，2月20日，星期六三、操作1.在層析缸中裝入展層劑，其高度約1.5～2cm。2.準備濾紙:

戴上手套，取層析濾紙（長22cm、寬14cm）一張，在紙的一端距邊緣3cm處用鉛筆畫一條直線，在此直線上每間隔2cm作一記號，為點樣位置（即原點），如圖。注意事項：手不能直接接觸濾紙；直線與底邊平行。3.點樣：用毛細管依次將Lys(賴)、

Gly(甘)、

Pro(脯)、Val(纈)、

Leu(亮)和混合樣品分別點在這6個位置上，點樣點干后再點一次。注意每點在紙上擴散的直徑，最大不超過3mm。第5頁，共10頁，2023年，2月20日，星期六

紙層析點樣標準圖

Lys

Gly

Pro

Val

Leu混合樣品第6頁，共10頁，2023年，2月20日，星期六4、展層：將點好樣的濾紙(點樣面朝外)卷成筒狀，用透明膠紙粘接或用線縫好，紙的兩邊不能接觸。將濾紙直立于層析缸中（注意：點樣的一端在下，展層劑的液面需低于點樣線1cm，濾紙勿與缸壁接觸），蓋好層析缸蓋，進行展層。待溶劑上升15～20cm時，取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，電吹風吹干。5、顯色：

用噴霧器均勻噴上0.1％水合茚三酮正丁醇溶液，然后用電吹風吹干即可顯出各層析斑點。第7頁，共10頁，2023年，2月20日，星期六

卷成筒狀的濾紙氨基酸顯色后的圖譜

溶劑前沿XY第8頁，共10頁，2023年，2月20日，星期六四、計算：

用直尺測量并計算出各種氨基酸的Rf值。

樣品aa標準aaRf混合aaRf賴氨酸甘氨酸脯氨酸纈氨酸亮氨酸第9頁，共10頁，2023年，2月20日，星期六試劑和器材：1.試劑：(1)氨基酸溶液：0.5%(m/V)的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液(各組分的濃度均為0.5％)。(2)展層劑：正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶3(V/V)。(3)顯色劑：0.1％(m/V)水合茚三酮正丁醇溶液。2.器材：層析缸