生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座

第六章

生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院劉蕓生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第1頁第一節(jié)生物大分子相互作用分析意義第二節(jié)常見生物大分子相互作用分析方法第三節(jié)生物大分子相互作用分析新進展（FRET、SPR）主要內(nèi)容生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第2頁真核生物細胞

eukaryoticcell原核生物細胞prokaryoticcell細胞結(jié)構(gòu)cell引言生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第3頁原核生物細胞結(jié)構(gòu)肽聚糖被膜質(zhì)膜引言生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第4頁動物細胞植物細胞細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核真核生物細胞結(jié)構(gòu)引言生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第5頁細胞中大分子

MacromoleculesinCellsTheapproximatecompositionofabacterialcell.引言生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第6頁分子水平DNAsequenceProteinsStructureFunction?AllCell第一節(jié)生物大分子相互作用分析意義生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第7頁DNAPrimarytranscriptmRNAmRNAInactivemRNAproteinnucleuscytoplasmTranscriptionalcontrolPost-transcriptionalcontrolmRNAdegradationcontroltranslationcontrolactiveproteinPost-translationcontrol基因表示調(diào)控層次生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第8頁ProteincomplexSignalingnetwork生命機制生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第9頁蛋白質(zhì)組學(xué)分類

表示蛋白質(zhì)組學(xué)Quantitativestudyofproteinexpressionbetweensamplesthatdifferbysomevariable

結(jié)構(gòu)基因組學(xué)Goalistomapoutthe3-Dstructureofproteinsandproteincomplexes

功效蛋白質(zhì)組學(xué)Tostudyprotein-proteininteraction,3-Dstructures,cellularlocalizationandPTMsinordertounderstandthephysiologicalfunctionofthewholesetofproteome.生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第10頁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和序列特點蛋白質(zhì)進化過程和保守序列蛋白質(zhì)表示譜蛋白在細胞內(nèi)定位及其相關(guān)聯(lián)細胞器或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)翻譯后修飾情況了解與其相關(guān)聯(lián)其它細胞蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)信息不一樣層次生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第11頁蛋白質(zhì)同源二聚體(homodimer)蛋白質(zhì)異源二聚體(heterodimer)蛋白質(zhì)多聚體(polymer)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物(protein-DNAcomplex)蛋白質(zhì)-脂質(zhì)復(fù)合物(protein-lipidcomplex)蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物(protein-RNAcomplex)DNA-DNA復(fù)合物(DNA-DNAcomplex)……生物大分子復(fù)合物類型生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第12頁第二節(jié)生物大分子相互作用分析技術(shù)

1.研究思緒2.分類3.技術(shù)介紹生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第13頁生物大分子相互作用分析研究思緒判定與目標分子相互作用全部可能大分子詳細描述其生物功效及相互作用對其功效影響判定出相互作用且在生理狀態(tài)下得到了驗證和合理解釋生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第14頁生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第15頁GST融合蛋白技術(shù)(GSTpull-down)免疫共沉淀(Immunoprecipitation,Co-IP

)串聯(lián)親和純化(TandemAffinityPurification，TAP)酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybrid)噬菌體展示(Phagedisplay)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位(Co-localization)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET)表面等離子共振(surfaceplasmonresonance，SPR)……生物大分子相互作用分析技術(shù)生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第16頁1.GST融合蛋白技術(shù)（GSTpull-downassay）——基于重組蛋白表示純化技術(shù)體外分析系統(tǒng)基本原理：是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目標蛋白親和支撐物,充當一個“誘餌蛋白”,目標蛋白溶液過柱,可從中捕捉與之相互作用“捕捉蛋白”(目標蛋白),洗脫結(jié)合物后經(jīng)過SDS電泳分析,從而證實兩種蛋白間相互作用或篩選對應(yīng)目標蛋白,“誘餌蛋白”和“捕捉蛋白”均可經(jīng)過細胞裂解物、純化蛋白、表示系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法取得。GST：谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase)生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第17頁GSTpull-downassayPurificationofproteinGlutathionecolumnGlutathionebeadGSTfusionprotein生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第18頁TagsPull-Down

方法組成RtagbaitpreyResin——樹脂Bait——誘餌蛋白Prey——捕捉蛋白Tags——標簽（GST,His,Flag,HA,MBP）生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第19頁RPull-downexperimentRWashRRAddpreyWashElutionAnalysisBaitPreyControlsRAddpreyWashRRElutionAnalysisSCSDSgel試驗設(shè)計思緒生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第20頁GSTXY谷胱甘肽-瓊脂糖微珠細胞裂解物

tube4℃下孵育2h

GST融合蛋白GSTXY+試驗流程生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第21頁GSTpull-down應(yīng)用判定未知相互作用蛋白判定預(yù)測或已知相互作用生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第22頁GSTpulldown驗證兩種已知蛋白質(zhì)（X-Y）相互作用舉例inputGSTY-GFP+++X-GSTY-GFP105kDAnti-GFPX-GFP+++GSTinputAnti-GFPY-GSTX-GFP生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第23頁2.免疫共沉淀（immunoprecipitation，Co-IP）——非常有效地用于判定細胞內(nèi)生理上蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗體和抗原之間專一性作用為基礎(chǔ)用于研究蛋白質(zhì)相互作用經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用有效方法。生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第24頁

基本原理：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間相互作用被保留了下來。假如用蛋白質(zhì)X抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。

GagaroseGagaroseXYGagarose生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第25頁試驗設(shè)計思緒生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第26頁試驗流程SDSProteinA/GSepharose＋＋誘餌蛋白質(zhì)抗體離心誘餌蛋白質(zhì)ProteinA/GSepharose離心傳統(tǒng)方法交聯(lián)方法生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第27頁基礎(chǔ)：細胞在非變性條件下裂解時，完整細胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)之間結(jié)合保持下來。要求：在一系列操作過程中保持蛋白質(zhì)復(fù)合體不變?nèi)秉c：可能檢測不到細胞內(nèi)處于動態(tài)平衡中低親和與瞬間相互作用,存在著免疫球蛋白污染，需要培養(yǎng)大量細胞局限：僅應(yīng)用于從細胞中溶解出來仍存在于生理復(fù)合物中蛋白質(zhì)生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第28頁Co-IP

應(yīng)用判定已知蛋白質(zhì)相互作用檢測判定新蛋白質(zhì)間相互作用生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第29頁免疫共沉淀驗證兩種已知蛋白質(zhì)相互作用Y-GFPY-GFP+X-HAIP:HAcontrolIgGAnti-GFPAnti-GFPAnti-HAY-GFPinput舉例生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第30頁3.串聯(lián)親和純化（TandemAffinityPurification，TAP）a.One-stepaffinitypurificationb.Two-stepaffinitypurification(tandemaffinitypurification)Affinitypurification(immunopurification)——融合了標準生化純化和免疫共沉淀策略極為有效快速純化蛋白質(zhì)復(fù)合物方法生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第31頁串聯(lián)親和純化技術(shù)優(yōu)勢與傳統(tǒng)生化純化方法相比與免疫共沉淀方法相比使用恒定標簽和標準純化條件防止了每次都要設(shè)計新純化方案問題多步驟純化降低了細胞高豐度蛋白質(zhì)以及免疫球蛋白背景污染生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第32頁雙親和標簽：

ProA（葡萄球菌蛋白A兩個免疫球蛋白IgG結(jié)合單位）

CBP（鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽）試驗設(shè)計思緒生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第33頁試驗流程鈣調(diào)素結(jié)合肽TEV酶切位點在Ca2+離子下結(jié)合TEV酶切用EGTA洗脫靶蛋白結(jié)合于IgG珠子充分洗滌后，在TEV蛋白酶作用下洗脫結(jié)合物鈣離子存在下，將首次洗脫物中蛋白質(zhì)結(jié)合于鈣調(diào)蛋白包被珠子上充分洗滌后，加入EGTA洗脫結(jié)合物生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第34頁4.酵母雙雜交（yeasttwo-hybridsystem）——基于在轉(zhuǎn)錄水平上直接在酵母細胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)之間相互作用遺傳學(xué)方法生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第35頁基本原理：基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程認識。前者可識別DNA上特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)整基因上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體其它成份作用，開啟它所調(diào)整基因轉(zhuǎn)錄。二個結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當部位打開，仍含有各自功效。而且不一樣兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因經(jīng)過激活報道基因表示探測蛋白－蛋白相互作用。經(jīng)典真核生長轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4都含有二個不一樣結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-bindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcription-activatingdomain，AD）。生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第36頁酵母雙雜交（yeasttwo-hybridsystem）三個基本組成部分表示誘餌蛋白載體，誘餌即我們感興趣蛋白，它和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。2.表示靶蛋白載體，靶蛋白能夠是一個已知蛋白，也能夠是cDNA或基因組文庫編碼蛋白。靶蛋白和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合。3.一個或多個匯報基因（如控制氨基酸合成基因、大腸桿菌lacZ基因等），位于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識別調(diào)控區(qū)下游。ADDBDgene+reporterMeasurableproduct+DBDbaitADpreyDBDAD生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第37頁試驗設(shè)計思緒Target:未知蛋白或?qū)⒀芯繉ο?DNAbindingdomainBait:已知蛋白+activationdomainTarget與Bait可交換轉(zhuǎn)入同一個酵母菌中ConstructtargetplasmidandbaitplasmidTransformationScreeningDNAextractionDNAsequencing生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第38頁YeastTwo-HybridAssaynucleushis-leu-trp-MeasurableproductDBDbaittrpADfishleureporterDBDADhisHISlacZ生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第39頁優(yōu)勢：酵母雙雜交方法優(yōu)勢及缺點采取酵母菌株敏感度高蛋白折疊易于篩選應(yīng)用范圍廣缺點：核內(nèi)作用假陽性假陰性轉(zhuǎn)化率生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第40頁酵母雙雜交方法應(yīng)用高靈敏度地檢測蛋白－蛋白相互作用確定蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域或主要活性位點尋找與靶蛋白相互作用新蛋白尋找含有藥品治療作用小分子肽尋找控制蛋白相互作用化合物蛋白相互作用圖譜繪制生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第41頁舉例酵母雙雜交前準備工作雙酶切驗證21kb5kb3.5kb2kb1.5kbM1M:marker1:pGBKT7-BD-X構(gòu)建誘餌質(zhì)粒誘餌蛋白表示X-BDGal4-BD檢測誘餌蛋白是否有毒性1

2

3Westernblot1.Yeast2.BD-yeast3.X-BD-yeast酵母生長曲線1.未轉(zhuǎn)化酵母2.BD-酵母3.X-BD-酵母生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第42頁酵母雙雜交結(jié)果SD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade+3-AT（20mM）舉例SD/-Trp/-LeuGal4-BD+Y-ADX-BD+Y-ADGal4-BD+Gal4-ADX-BD+Gal4-AD生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第43頁

X-β-半乳糖苷酶藍白斑顯色分析舉例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第44頁酵母雙雜交測序結(jié)果酵母雙雜交得到陽性克隆子質(zhì)粒經(jīng)過DNA測序，由NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST檢索cDNA編碼蛋白質(zhì)舉例生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第45頁5.噬菌體展示技術(shù)（Phagedisplay）——基于將某個蛋白與其遺傳信息之間直接聯(lián)絡(luò)篩選方法

噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因適當位置，使外源基因隨外殼蛋白表示而表示，同時，外源蛋白隨噬菌體重新組裝而展示到噬菌體表面生物技術(shù)。到當前為止，人們已開發(fā)出了單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)等數(shù)種噬菌體展示系統(tǒng)。生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第46頁特點

該技術(shù)主要特點是將特定分子基因型和表型統(tǒng)一在同一病毒顆粒內(nèi)，即在噬菌體表面展示特定蛋白質(zhì)，而在噬菌體關(guān)鍵DNA中則含有該蛋白結(jié)構(gòu)基因。另外，這項技術(shù)把基因表示產(chǎn)物與親和篩選結(jié)合起來，能夠利用適當靶蛋白將目標蛋白或多肽挑選出來。生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第47頁UsedforcloningforeigngenesamongotherapplicationsProteinsandpeptidesarefusedtotheCapsid(surface)ofthephageThecombinationofthephageandpeptideisknownasaFusionProtein試驗設(shè)計思緒生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第48頁phagesFilamentousphagesM13FdF1OthersT4λ生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第49頁FilamentousphagesInfectmanygram-negativebacteriaCircularsinglestrandedDNAgenomeAbout6.4kb.p.Long,flexibletubestructureabout1μmlongand6.5nmindiameterReproducedandsecretedfrominfectedbacteriawithoutcellkillingorlysis(lysogenicphage)生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第50頁(a)Adenovirus.(b)Rotavirus.(c)Influenzavirus(courtesyofGeorgeLeser).(d)Vesicularstomatitisvirus.(e)Tobaccomosaicvirus.(f)Alfalfamosaicvirus.(g)T4bacteriophage.(h)M13bacteriophage.M13噬菌體顆粒結(jié)構(gòu)生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第51頁M13噬菌體生活史其裂解周期為：1)吸附(adsorption)2)侵入(entory)3)復(fù)制（生物合成biosynthesis）4)成熟(maturation)5)裝配(assembly)6)釋放(release)生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第52頁絲狀噬菌體基因及蛋白結(jié)構(gòu)http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1415-4757000100001&script=sci_arttext

pIII(406aa,5~8copies)pVIII(50aa,~2700copies)pVI(112aa,5~8copies)生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第53頁載體插入位點

生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第54頁pIII和pVIII噬菌體展示系統(tǒng)pIII系統(tǒng)pVIII系統(tǒng)拷貝數(shù)少多多肽片段大小大<10個氨基酸親和力高低適用范圍慣用于展示由cDNA和基因組序列編碼多肽，范圍較廣展示小肽，范圍較窄生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第55頁T7噬菌體展示篩選系統(tǒng)測序分析插入序列將噬菌體文庫鋪在固定靶蛋白上洗脫未結(jié)合噬菌體加入大腸桿菌，擴增和富集洗脫噬菌體鋪富集文庫鋪盤分離單個克隆3~4輪篩選驗證試驗：結(jié)合試驗試驗流程生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第56頁

優(yōu)點：

A.高通量淘選：將靶標分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽庫（噬菌體數(shù)量可達1011PFU），利用抗原-抗體特異性親和力將與抗體結(jié)合噬菌體吸附在固相載體上，不能結(jié)合噬菌體仍在溶液中，能夠經(jīng)過洗滌去除，再將特異結(jié)合噬菌體洗脫下來，如此重復(fù)數(shù)輪擴增、淘選，即可將有用基因從多達百萬以上噬菌體克隆中分離出來。

B.可用于模擬表位篩選：利用噬菌體展示技術(shù)得到模擬表位報道較多模擬表位一樣可誘發(fā)與天然表位相同特異性免疫反應(yīng)，比如利用乙肝病毒模擬表位免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度乙肝病毒抗體。

C.易于純化重組噬菌體純化步驟簡單、不要求昂貴試劑與設(shè)備，在普通試驗室條件下就能夠完成。缺點：首先，當前所建肽庫容量只能到達109，要想構(gòu)建大片段肽庫很困難。其次，需要處理肽庫多樣性問題。第三，少數(shù)多肽因為疏水性過強，或因為影響外膜蛋白折疊而不能展示在噬菌體表面。噬菌體展示系統(tǒng)應(yīng)用及優(yōu)缺點生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第57頁6、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位（cellularco-localization）——基于細胞內(nèi)綠色蛋白示蹤技術(shù)蛋白質(zhì)間相互研究方法生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第58頁綠色熒光羅丹明染色重疊相差舉例細胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位研究兩種已知蛋白質(zhì)時空表示關(guān)系生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第59頁舉例生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第60頁第三節(jié)

生物大分子相互作用分析新技術(shù)

生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第61頁1、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET）——能夠?qū)τ诩毎械鞍踪|(zhì)間相互作用或?qū)ψ饔眠M行實時原位分析檢測方法供體熒光素受體熒光素生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第62頁FRET現(xiàn)象

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NOBindingFRET:TheSize

當一個熒光分子(又稱為供體分子)熒光光譜與另一個熒光分子(又稱為受體分子)激發(fā)光譜相重合時，供體熒光分子激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時供體熒光分子本身熒光強度衰減。FRET程度與供、受體分子空間距離緊密相關(guān)，普通為7～10nm時即可發(fā)生FRET；伴隨距離延長，F(xiàn)RET呈顯著減弱.生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第63頁試驗設(shè)計InteractionXCFPYYFPUVlaserFRETYellowlightemissionYYFPXCFPUVlaserCyanlightemissionDonorAcceptor生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第64頁FRET能量供體和受體滿足條件：

供體受體激發(fā)光譜要分得足夠開；供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜要重合；供受體發(fā)射光譜要足夠分開。生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第65頁CFPYFPWavelength(nm)Normalizedintensity(%)GFP綠色熒光蛋白CFP(青色熒光蛋白)(第66位Tyr→Trp)(第203位Thr→Tyr)YFP(黃色熒光蛋白)CFP(λ433nm

/λ476nm)YFP(λ513nm/λ527nm)FRET能量供體和受體生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第66頁

均相檢測（無分離和洗滌步驟）實時連續(xù)地觀察活細胞動態(tài)改變FRET技術(shù)優(yōu)勢FluorescenceIntensityTime

LigandCy3Cy5生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第67頁ABCIntermolecularDirectIndirectKinaseStep2Step1FRET應(yīng)用類型生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第68頁生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第69頁FRET應(yīng)用范圍酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)所篩選克隆復(fù)證蛋白質(zhì)—核酸相互作用酶活性分析 蛋白酶、磷酸激酶鈣流檢測、離子通道研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第70頁FRET應(yīng)用不足信噪比經(jīng)常不佳，通常為1：1

背景主要來自受體被直接激發(fā)信號檢測儀器靈敏度、分辨率以及計算機影像采集和分析軟件能力生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第71頁2、表面等離子共振技術(shù)（surfaceplasmonresonance，SPR）——適合于各種類型分子而且無需借助標識物能夠?qū)崿F(xiàn)對復(fù)合物直接實時測定方法

SPRimager?II

生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第72頁

基本原理：基于表面等離子共振（SPR）技術(shù)來實時跟蹤生物分子間相互作用，而不用任何標識物。試驗時先將一個生物分子固定在傳感器芯片表面，將與之相互作用分子溶于溶液流過芯片表面。檢測器能跟蹤檢測溶液中分子與芯片表面分子結(jié)合、解離整個過程改變。

生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第73頁SPR現(xiàn)象SPRangle450?goldlayerp-Polarized

Light表面等離子共振（SPR）是一個物理現(xiàn)象，當入射光以臨界角入射到兩種不一樣折射率介質(zhì)界面（比如玻璃表面金或銀鍍層）時，可引發(fā)金屬自由電子共振，因為電子吸收了光能量，從而使反射光在一定角度內(nèi)大大減弱。其中，使反射光在一定角度內(nèi)完全消失入射角稱為SPR角。SPR隨表面折射率改變而改變，而折射率改變又和結(jié)合在金屬表面生物分子質(zhì)量成正比。所以能夠經(jīng)過獲取生物反應(yīng)過程中SPR角動態(tài)改變，得到生物分子之間相互作用特異性信號。

生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第74頁SPR角度——掃描曲線SPRangle生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第75頁傳統(tǒng)檢測原理SPRangleshiftasbasisofmeasurement生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第76頁SPRimaging檢測原理Fixedangle,fixedwavelengthD%RReflectivitychangeasbasisofmeasurement生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第77頁SPRimager系統(tǒng)RotatingStage流動相（含待分析物）Gold-coatedglassSPRchip?p-pollight棱鏡分子探針陣列生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第78頁GWC’s“SPRImaging”

技術(shù)生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第79頁BioarrayTerminologySPRchip?glassgoldattachmentchemistryBiosensorAnalyteProbe生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第80頁MonitoringChanges:DifferenceImages=SA+Bim-PEGn-PEGSASAProbeArrayProbeArray+BiotinT7DifferenceImage:signalduetobindingofBiotinT7toStreptavidinABAB-生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第81頁MonitoringChanges:Image+Chart生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第82頁ValueofReal-TimeMonitoringProteinArray,

EndofExperimentAg

SA

ConAddBiotinylatedAntibodyD%RminEnd-pointmeasurementsmissalltheaction生物大分子相互作用分析技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)專家講座第83頁優(yōu)點：分子