免疫組化he染色fishish

免疫組化he染色fishish免疫組化he染色fishish第1頁

免疫組化

1、免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合原理，經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)識抗體顯色劑

(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及定量研究，稱為免疫組織化學(xué)。

2、咱們現(xiàn)階段主要要做組織免疫組化有石蠟切片、冰凍切片免疫組化以及熒光免疫組化。細(xì)胞免疫組化有細(xì)胞爬片、細(xì)胞印片和細(xì)胞涂片免疫組化和熒光免疫組化。3、免疫組化過程中抗原修復(fù)有高壓修復(fù)法、酶修復(fù)、微波修復(fù)，其中微波修復(fù)抗原對提升免疫組化陽性檢出率非常有效。4、高壓修復(fù)和微波修復(fù)法中常見緩沖液有0.01M檸檬酸緩沖液、1mMEDTA（pH8.0）。免疫組化he染色fishish第2頁6、酶標(biāo)抗體系統(tǒng)中酶與顯色劑、復(fù)染液合理選?。海?）辣根過氧化物酶系統(tǒng)（HRP）顯色劑普通用DAB、AEC,DAB顯色液普通染色部位為棕黃色，AEC顯色液普通染色部位為紅色；而HRP系統(tǒng)常見復(fù)染液為蘇木素，將細(xì)胞核染成藍(lán)色。（2）堿性磷酸酶系統(tǒng)（AP）顯色劑普通用BCIP/NBT、固紅、固藍(lán)。最常見是BCIP/NBT顯色液，染色部位為深藍(lán)色或者藍(lán)紫色；該系統(tǒng)常見復(fù)染液為核固紅，將細(xì)胞核染成紅色。免疫組化he染色fishish第3頁

免疫組化切片組織前期處理1、組織塊大小應(yīng)限于2cm×1.5cm×0.2cm。2、應(yīng)用于光鏡免疫組織化學(xué)染色切片厚度普通要求5μm左右，神經(jīng)組織研究要求切片厚度在20-100μm，有利于追蹤神經(jīng)纖維走行。3、石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù)，切片厚度2～7μm，應(yīng)用范圍廣，不影響抗體穿透性，染色均勻一致。4、組織固定：4%多聚甲醛固定普通1-2小時。固定后經(jīng)充分流水沖洗后進(jìn)行脫水包埋。5、組織脫水：主要用不一樣梯度酒精進(jìn)行脫水。普通情況下，組織經(jīng)過70％，80％，90％，95％，以至無水酒精脫水程序，即可到達(dá)脫水要求。不過為了能使大量組織塊同時進(jìn)行脫水，則要求保持液體濃度以確保脫水作用，最好是以兩次95％酒精，兩次100％酒精重復(fù)進(jìn)行脫水，以確保組織水分脫凈。6、組織透明：咱們普通采取二甲苯透明，30-60min即可。免疫組化he染色fishish第4頁5、石蠟切片：浸蠟、包埋過程中，石蠟應(yīng)保持在60℃以下，以熔點低軟蠟很好,浸蠟時間1－4小時。6、冰凍切片：組織采取液氮法包埋。將未固定組織放入OCT包埋劑中對組織進(jìn)行液氮包埋，包埋后放在-80度冰箱中貯存或者對其進(jìn)行切片?；蛘邔⒔M織置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高滲吸收組織中水分，降低組織含水量，再放入OCT包埋劑中進(jìn)行包埋。

7、切片固定：冰凍切片、細(xì)胞切片常見固定液為4℃丙酮或者4%多聚甲醛，固定10-30min。免疫組化he染色fishish第5頁

石蠟切片免疫組化1、石蠟切片脫蠟至水。2、3%H2O2室溫孵育5-10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，水洗，5min×3次。3、依據(jù)客戶抗體要求進(jìn)行修復(fù)，PBS沖洗，2min×3次。4、5-10%正常山羊血清封閉（5%BSA封閉20-30min），室溫孵育20-30min。傾去血清，勿洗。5、滴加適當(dāng)百分比稀釋一抗或一抗工作液（PBS配制），37℃孵育1-2小時或4℃過夜。（室溫20-30min，再放于37℃孵育20-30min）6、PBS沖洗，2min×3次。7、滴加適當(dāng)百分比稀釋生物素標(biāo)識二抗，37℃孵育10-30min。8、PBS沖洗，2min×3次。9、滴加即用型SABC，37℃孵育10-30minPBS沖洗，5min×4次。10、顯色劑顯色（DAB或AEC）。11、自來水充分沖洗，復(fù)染（蘇木素），脫水透明，封片。返回

B免疫組化he染色fishish第6頁石蠟切片免疫組化DAB顯色免疫組化he染色fishish第7頁

血涂片，細(xì)胞，冰凍切片免疫組化1、冰凍切片4-8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲存于-20℃冰箱。2、室溫放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。PBS沖洗5min×3次。3、30%過氧化氫1份+純甲醇50份混合，室溫浸泡30min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水洗2次。4、其余步驟和石蠟切片免疫組化4-11步相同。注：假如冰凍切片直接染色結(jié)果不理想時，能夠參考石蠟切片對切片進(jìn)行熱修復(fù)，方法和石蠟切片3-11步相同。免疫組化he染色fishish第8頁

石蠟切片熒光免疫組化1、石蠟切片脫蠟至水。

2、與石蠟切片免疫組化3-8步驟相同。3、加入SABC-FITC,37℃孵育10-30min，PBS沖洗，5min×4次。4、抗熒光萃滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察。免疫組化he染色fishish第9頁

冰凍切片熒光免疫組化1、冰凍切片4-8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲存于-20℃冰箱。2、室溫放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。PBS沖洗5min×3次。3、5-10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10-30min。傾去血清，勿洗。4、滴加適當(dāng)百分比稀釋一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小時或4℃過夜。5、PBS沖洗，5min×3次。6、滴加適當(dāng)百分比稀釋生物素標(biāo)識二抗，37℃孵育10-30min；或滴加第二代生物素標(biāo)識二抗工作液，37℃或室溫孵育10-20min。7、PBS沖洗，5min×3次。8、滴加SABC-FITC,37℃孵育10-30min，PBS沖洗5min×3次。9、抗熒光萃滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察。免疫組化he染色fishish第10頁

細(xì)胞爬片免疫組化1、取出培養(yǎng)皿，用PBS漂洗2min×2次.2、4℃冷丙酮或4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片，室溫10-30分鐘。PBS漂洗2min×3次。0.5%TritonX-100室溫處理20min。PBS洗2min×3次，3%過氧化氫室溫處理15min，PBS洗2min×3次。3、血清封閉：室溫10-30分鐘，傾去。4、一抗：37℃1小時或4度過夜5、0.1MPBS洗三次------每次三分鐘。6、對應(yīng)生物素化二抗37℃30-40分鐘。7、0.1MPBS洗三次------每次三分鐘。8、鏈酶卵白素-堿磷酶復(fù)合物或過氧化物酶標(biāo)識鏈酶卵白素37℃40min。9、NBT/BCIP或DAB顯色，核固紅或蘇木素復(fù)染。10、切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，(二甲苯透明)，中性樹膠封片；免疫組化he染色fishish第11頁注意事項：1、良好細(xì)胞爬片是進(jìn)行免疫組織細(xì)胞基礎(chǔ)，要取得良好細(xì)胞爬片須注意以下：（1）對于粘附分子較少細(xì)胞爬片時間要達(dá)5天以上，這么細(xì)胞爬片才較牢靠，沖洗時不易脫片；（2）接種細(xì)胞密度適中，以2*104/ml為宜，若細(xì)胞密度太高，5天后細(xì)胞連接成片沖洗時易脫片；2、冰丙酮固定后玻片可密閉保留于4度冰箱，冰丙酮固定時會使細(xì)胞收縮，可用80%冰丙酮或4%多聚甲醛固定。3、沖洗時只須輕輕振蕩培養(yǎng)皿，（不可用吸管太用力吹，易脫片）4、加一抗、二抗后沖洗時第一次須將玻片傾斜5、TritonX-100（曲拉通）表面活性劑，脫去細(xì)胞膜中最主要成份脂質(zhì)，對于抗原表示在胞漿或胞核者方使用，對于抗原表示在胞漿者時間要控制好，使其破壞細(xì)胞膜而核膜破壞較少。免疫組化he染色fishish第12頁

免疫組化中常見固定液1.冷丙酮可用于普通免疫組化染色。將純丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮（放心，丙酮在此溫度不會為固體）細(xì)胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很強揮發(fā)性，注意將含有丙酮和爬片器皿蓋嚴(yán)，預(yù)防其揮發(fā)）固定10分鐘。取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保留。2.多聚甲醛(常見4%)：可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱抗原尤其是細(xì)胞表面抗原，比如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保留3.95％乙醇，可用于免疫組化。優(yōu)點：穿透性強、抗原性保留很好。缺點：醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保留效果較差，使蛋白變性作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強度室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保留4.甲醛(福爾馬林)應(yīng)用最廣優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保留好，且穿透性強，缺點：甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；分子間交聯(lián)形成網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能個別或完全掩蓋一些抗原決定簇，使之不能充分暴露?？稍斐杉訇幮匀旧Y(jié)果。返回免疫組化he染色fishish第13頁

HE染色

蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE)是石蠟切片技術(shù)里常見染色法之一。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基礎(chǔ)、使用最廣泛技術(shù)方法。

HE染色原理：脫氧核糖核酸（DNA）兩條鏈上磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很輕易與帶正電荷蘇木精堿性染料以離子鍵結(jié)合而被染色。伊紅是一個化學(xué)合成酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷陰離子，與蛋白質(zhì)氨基正電荷陽離子結(jié)合使胞漿染成紅色或粉紅色，與藍(lán)色細(xì)胞核形成鮮明對比。免疫組化he染色fishish第14頁石蠟切片HE染色步驟：1、脫蠟水合。2、蒸餾水洗5min×3次。3、蘇木素染液染色，鏡下控制染色時間。4、水洗玻片上多出染液，0.5-1%鹽酸酒精分色數(shù)秒。5、流水沖洗15-30s，細(xì)胞核呈藍(lán)色。6、0.5%伊紅染液染色1-5min。蒸餾水浸泡5min。7、風(fēng)干，封片。免疫組化he染色fishish第15頁細(xì)胞爬片HE染色1、取出細(xì)胞爬片，用PBS洗滌3次。2、樣品固定：95％乙醇固定20min，PBS洗滌2次，每次2min。3、其余步驟和石蠟切片3-7步相同。冰凍切片HE染色1、固定：固定1-2min。(配制方法：40%福爾馬林15mL，95%乙醇80mL，冰乙酸5mL)2、其余步驟和石蠟切片2-7步相同。染色結(jié)果：細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿呈紅色，紅細(xì)胞呈桔紅色，其它部位呈深淺不一樣紅色。免疫組化he染色fishish第16頁返回免疫組化he染色fishish第17頁

常見特殊染色一、彈力纖維染色1、彈性纖維主要由彈性蛋白（一個黃色硬蛋白，它是黃色彈性纖維組織主要成份，干燥時易脆，而濕潤時呈彎曲并富彈性）組成。新鮮時它呈黃色，固又稱為黃色纖維。彈性纖維較細(xì)，直徑0.2-1.0um，有分支，不成束。但可交織成網(wǎng)。它富有彈性，輕易拉長，但不能拉到超出它極限，外力除去后又恢復(fù)原狀。2、彈性纖維染色臨床應(yīng)用1）用于區(qū)分正常動脈和靜脈以及觀察動脈有病變時血管壁各層情況，如動脈粥樣硬化時各類改變。2）用于區(qū)分觀察各種疾病對彈性纖維影響及改變，如原發(fā)性或繼發(fā)性高血壓可見主動脈彈力纖維增生，老年彈力纖維增多癥。心內(nèi)膜彈力纖維增生癥常都可見到彈力纖維斷裂，梅毒性主動脈炎和皮膚環(huán)狀肉芽腫，動脈粥樣硬化均可見到裂解，崩解彈力纖維。3）用于彈力纖維性假黃瘤診療。該病鏡下見真皮中下部結(jié)締組織變性，呈團(tuán)塊狀或條索狀，弱嗜堿性用彈力纖維染色法能夠判別。免疫組化he染色fishish第18頁3、彈性纖維染色方法：維格特氏雷鎖辛品紅法、Gomori‘s醛品紅法、地衣紅技術(shù)、費爾霍夫氏酒精蘇木素技術(shù)。二、Masson染色Masson染色,用于顯示組織中纖維染色方法之一。普通Masson染色用是三色法，苯胺藍(lán)染液使膠原纖維、粘液、軟骨呈藍(lán)色(如光綠液染色為綠色)，Masson麗春紅酸性復(fù)紅液使胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，Regaud氏蘇木精染液使細(xì)胞胞核黑藍(lán)色。三、網(wǎng)狀纖維染色1、網(wǎng)狀纖維在組織化學(xué)上反應(yīng)網(wǎng)狀纖維主要成份是網(wǎng)硬蛋白，在組織化學(xué)上，網(wǎng)狀纖維和膠原纖維是輕易區(qū)分。網(wǎng)狀纖維是分支纖細(xì)纖維。VanGieson氏染色不顯色或微紅色。PAS反應(yīng)展現(xiàn)紅紫色，銀浸染為黑色。膠原纖維用VanGieson氏染色為紅色，PAS反應(yīng)呈微粉紅色。銀浸染為黃色或棕黃色。免疫組化he染色fishish第19頁2、臨床應(yīng)用1）可用于區(qū)分癌和肉瘤診療。比如：網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤和轉(zhuǎn)移于淋巴結(jié)內(nèi)未分化癌，這二者在HE染色切片都較難區(qū)分，前者可產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維，后者不產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維。鼻咽部活柱，應(yīng)將網(wǎng)染作為常規(guī)，給予使用，可增加診療準(zhǔn)確性。2）可用于區(qū)分血管內(nèi)皮瘤（肉瘤）和血管外皮瘤（肉瘤），它瘤細(xì)胞在網(wǎng)狀纖維膜內(nèi)，而血管外皮瘤則在網(wǎng)狀纖維膜外，血管內(nèi)皮肉瘤瘤細(xì)胞呈泡巢狀，周圍多被網(wǎng)狀纖維包繞；而血管外皮肉瘤瘤細(xì)胞可見較多網(wǎng)狀纖維。3）可用于神經(jīng)系統(tǒng)方面腫瘤區(qū)分。如：交感神經(jīng)母細(xì)胞，腦髓母細(xì)胞瘤，這些腫瘤形態(tài)有時象肉瘤，但銀染時，神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)染為陰性，不過腦原發(fā)性肉瘤有較多網(wǎng)狀纖維。4）可用于觀察癌組織發(fā)生發(fā)展過程。如：原位癌，可見有完整基底膜，而浸潤性癌則可見到被破壞基底膜。5）可用于區(qū)分淋巴系統(tǒng)方面腫瘤。如：淋巴肉瘤和網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤，前者瘤細(xì)胞間網(wǎng)狀纖維比正常稍降低，后者則比正常時增多。6）可用于急性骨髓纖維化判別診療，該病網(wǎng)狀纖維增多，纖維能夠是致密和融合性。膠原纖維染色通常呈陰性，盡管偶然有病例可能顯示膠原纖維化。免疫組化he染色fishish第20頁四、VanGieson染色1、結(jié)果：膠原纖維染成鮮紅色；肌纖維染成黃色；紅細(xì)胞染成黃色；細(xì)胞核染成藍(lán)黑或灰色。2、臨床應(yīng)用：膠原纖維發(fā)生病變?nèi)鐗乃阑蛲该髯冃詴r，它與淀粉樣物在HE染色時被染為粉紅色，不好區(qū)分。應(yīng)用V.G染色法，能將膠原纖維染為粉紅色，而淀粉樣物將被染為黃色。返回免疫組化he染色fishish第21頁

敏感性加強型原位雜交（AP）

原位雜交(ISH)是一個可在細(xì)胞涂片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測DNA或RNA技術(shù)，此方法原理是由DNA或RNA序列與互補標(biāo)識單鏈DNA/RNA探針結(jié)合形成標(biāo)識雙鏈雜交分子，本技術(shù)可對組織細(xì)胞原位待測核酸分子進(jìn)行定性，定量及定位分析。在細(xì)胞分化調(diào)整、基因定位、腫瘤遺傳學(xué)、分子病理學(xué)、病毒學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。敏感性加強型原位雜交（AP）僅適應(yīng)于地高辛高效標(biāo)識寡核苷酸探針。免疫組化he染色fishish第22頁一、培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片1、培養(yǎng)好細(xì)胞用0.1MPBS洗2min×3次。2、培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：4%多聚甲醛，室溫固定20-30min。蒸餾水洗，干燥后-20℃保留。3、暴露mRNA核酸片段。胃蛋白酶37℃消化5-120s，0.5MTBS洗滌5min×3次，蒸餾水洗滌1次。4、預(yù)雜交5、雜交6、雜交后洗滌7、滴加封閉液。37℃30min8、滴加生物素化鼠抗地高辛。37℃60min免疫組化he染色fishish第23頁9、0.5MTBS洗滌5min×4次。10、滴加SABC-AP37℃20min。0.5MTBS洗滌5min×4次。11、BCIP/NBT顯色，核固紅復(fù)染。13、風(fēng)干，水溶性封片劑封片。二、石蠟切片1、常規(guī)脫蠟至水。2、3%過氧化氫室溫處理10min，蒸餾水洗5min×2次.3、暴露暴露mRNA核酸片段。胃蛋白酶37℃消化10-30min，0.5MTBS洗滌5min×3次，蒸餾水洗滌1次。4、其余步驟和冰凍切片4-13步相同。免疫組化he染色fishish第24頁三、結(jié)果觀察陽性細(xì)胞胞漿著色呈深藍(lán)色或藍(lán)紫色，細(xì)胞核著色呈紅色（圖片）四、注意事項

1、石蠟切片水合時所用不一樣濃度酒精用0.1%DEPC水配制。2、緩沖液配制時要用滅菌水來配。3、試驗過程中所用3%檸檬酸需現(xiàn)配現(xiàn)用。

4、在冰凍切片原位雜交試驗中最主要組織及細(xì)胞及時固定，并在固定液中加入0.1%DEPC水處理，以抑制RNA酶對mRNA分解作用。

5、石蠟切片脫蠟時要用新二甲苯浸泡，不能要以前浸泡過切片二甲苯脫蠟。返回免疫組化he染色fishish第25頁microRNA原位雜交圖片返回免疫組化he染色fishish第26頁

熒光原位雜交（FISH）

熒光原位雜交技術(shù)(florescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)是一個利用熒光信號對原位雜交樣本進(jìn)行檢測技術(shù)。它將