蛋白質(zhì)分析技術(shù)

蛋白質(zhì)分析技術(shù)第1頁(yè)/共46頁(yè)

蛋白質(zhì)分析技術(shù)是用來(lái)分析蛋白質(zhì)的含量、純度、氨基酸組成和結(jié)構(gòu)的技術(shù)。常規(guī)的蛋白分析技術(shù)包括蛋白質(zhì)的分離純化、蛋白質(zhì)含量測(cè)定、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)等方面。第五章蛋白質(zhì)分析技術(shù)王2頁(yè)/共46頁(yè)第一節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化

研究蛋白質(zhì)，首先要得到高純度并具有生物活性的蛋白質(zhì)標(biāo)本。

蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞中一般都是以復(fù)雜的混合物形式存在，在生物樣品中除含有目的蛋白質(zhì)外，還含有其他蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)和核酸等混雜物質(zhì)。一、蛋白質(zhì)分離純化的目的：

要研究或制備某種蛋白制劑必須進(jìn)行分離純化。第3頁(yè)/共46頁(yè)

能從成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)混合物中純化出一種蛋白質(zhì)，是因?yàn)椴煌鞍踪|(zhì)的理化和生物學(xué)性質(zhì)有著極大的不同，這些差異主要是組成蛋白質(zhì)的氨基酸序列和數(shù)目不同，使不同多肽鏈的分子量、帶電狀況、親水性等存在差異，同時(shí)不同多肽鏈所折疊成的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)也存在差異，利用待分離的蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)之間存在的這些差異，即能設(shè)計(jì)出一個(gè)合理的分離方案。二、分離純化的理論基礎(chǔ)：第4頁(yè)/共46頁(yè)

根據(jù)蛋白質(zhì)的種類(lèi)、性質(zhì)、所處體系以及分離純化的目的不同，分離純化的步驟也不相同，但是多數(shù)分離純化工作中都有相類(lèi)似步驟與手段，如下圖所示。三、分離純化的主要步驟：第5頁(yè)/共46頁(yè)第6頁(yè)/共46頁(yè)四、分離純化的操作步驟（一）選擇材料和預(yù)處理

選擇材料要依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康募白裱韵略瓌t：①選擇有效成分含量高的新鮮材料；②材料來(lái)源豐富易得；③獲取工藝簡(jiǎn)單易行；④成本比較低。

目標(biāo)蛋白質(zhì)含量受到原料的種屬、季節(jié)、發(fā)育階段、生物狀態(tài)、來(lái)源、解剖部位、生物技術(shù)產(chǎn)品宿主菌或細(xì)胞的培養(yǎng)條件的影響。第7頁(yè)/共46頁(yè)材料選定后，通常進(jìn)行預(yù)處理：將不必要的結(jié)締組織、脂肪組織等在盡可能接近生命狀態(tài)下剔除，處理后應(yīng)立即使用或在冷庫(kù)中保存。制備某些在體內(nèi)易被分解的活性蛋白質(zhì)、酶類(lèi)或蛋白激素時(shí)，必須選用新鮮材料。（二）細(xì)胞的破碎

對(duì)于組織細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的分離純化都需事先將組織細(xì)胞破碎，使蛋白質(zhì)充分釋放出來(lái)。第8頁(yè)/共46頁(yè)

不同的生物體或不同的組織，細(xì)胞破碎難易不一，使用的方法也不盡相同。胰臟、肝臟、腦組織一般比較柔軟，用普通的勻漿器研磨即可；肌肉、心臟組織較韌，需預(yù)先剪碎再作勻漿；許多微生物都有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，需用自镕、冷熱交替、加砂研磨、超聲波和加壓處理等方法。目前已建立了多種破碎細(xì)胞的方法，根據(jù)作用方式的不同可分為機(jī)械法、物理法、化學(xué)法三大類(lèi)。第9頁(yè)/共46頁(yè)1、機(jī)械法通過(guò)機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破碎的方法稱(chēng)為機(jī)械法，如勻漿、研磨等。

（1）勻漿：勻漿是破碎軟組織最常用的方法。其原理是利用勻漿器剪切力破壞組織和細(xì)胞，釋放蛋白質(zhì)進(jìn)入溶液。勻漿器有四大類(lèi)，刀片式組織破碎勻漿器、內(nèi)切式組織勻漿器、玻璃勻漿器及用于規(guī)模生產(chǎn)的高壓勻漿器。第10頁(yè)/共46頁(yè)（2）高速組織搗碎：此法適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。（3）研磨：研磨是破碎單一細(xì)胞的有效方法。借助于研磨中磨料和細(xì)胞間的剪切力及碰撞作用破碎細(xì)胞。常用的磨料為石英沙、氧化鋁等。主要用于細(xì)菌、酵母等的破碎。第11頁(yè)/共46頁(yè)2、物理法通過(guò)各種物理因素使組織細(xì)胞破碎的方法稱(chēng)為物理法。（1）超聲法：利用超聲波作用于溶液產(chǎn)生的震蕩沖擊波使細(xì)胞裂解。超聲波破碎的效率取決于頻率、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及細(xì)胞類(lèi)型等。超聲波破碎操作簡(jiǎn)便，效率高，樣品損失少，適用于微生物材料。例如：用大腸桿菌制備各種酶。破碎過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的熱應(yīng)采取降溫措施。第12頁(yè)/共46頁(yè)（2）反復(fù)凍融法：把待破碎的樣品冷至－15～－20℃，使之凝固，然后緩慢地溶解，如此反復(fù)操作，大部分動(dòng)物細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆粒可以破碎。此過(guò)程易使活性蛋白失活。（3）冷熱交替法：將材料投入90℃水中維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴，使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破碎。此法適用于從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)。第13頁(yè)/共46頁(yè)（4）低滲裂解法：無(wú)胞壁細(xì)胞在低滲溶液中通過(guò)滲透張力作用裂解的方法，常用于紅細(xì)胞的裂解。（5）加壓破碎法：加氣壓或水壓（如上海高壓勻漿泵廠生產(chǎn)的高壓勻質(zhì)機(jī)），達(dá)20.59～34.32（兆帕）MPa（210～350kgf／cm2）的壓力時(shí)，可使90%以上細(xì)胞被壓碎。多用于微生物酶制劑的工業(yè)制備。第14頁(yè)/共46頁(yè)3、化學(xué)法（1）有機(jī)溶劑：有機(jī)溶劑(苯、甲苯)可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性，使內(nèi)含物有選擇性的滲透出來(lái)。

丙酮可以破碎細(xì)胞膜，而且可以制成具有活性的蛋白干粉，即丙酮粉，它能長(zhǎng)時(shí)間保存，另外它還可以脫去脂肪，便于后續(xù)的抽提。（2）表面活性劑：表面活性劑的分子中，兼有親脂性和親水性基團(tuán)，能降低水的界面張力，具有乳化、分散、增溶作用。較常用的有十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。第15頁(yè)/共46頁(yè)（3）酶解：用生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消化溶解的方法稱(chēng)為酶解法。利用此法處理細(xì)胞必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿福纾喝芫福↙ysozyme）是專(zhuān)一破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的酶；蝸牛酶用于酵母細(xì)胞的破碎；用胰酶處理豬腦制備腦安素。用于專(zhuān)一性分解細(xì)胞壁的酶還有纖維素酶（破壞植物細(xì)胞）、細(xì)菌蛋白酶、酯酶、殼糖酶等。酶解時(shí)，應(yīng)注意控制溫度、酸堿度、酶用量、先后次序及時(shí)間。第16頁(yè)/共46頁(yè)

無(wú)論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解酶和核酸水解酶釋放到溶液中，使生物大分子降解，導(dǎo)致天然物含量減少。為了防止天然物被降解可加入二異丙基氟磷酸(DFP)抑制或減慢自溶作用，加入碘乙酸可以抑制活性中心需要有巰基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能抑制蛋白水解酶的活力。第17頁(yè)/共46頁(yè)（三）細(xì)胞器的分離

細(xì)胞內(nèi)各種不同細(xì)胞器的密度和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來(lái)。

分離細(xì)胞器最常用的方法是差速離心法，其過(guò)程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)離心和分析三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。第18頁(yè)/共46頁(yè)（四）分離純化目的蛋白

1、根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小差別分離的方法：蛋白質(zhì)分子是高分子化合物，其種類(lèi)繁多，分子質(zhì)量差別很大，據(jù)此可設(shè)計(jì)一些分離純化的方法，使蛋白質(zhì)混合物得到初步分離。（1）透析和超濾：半透膜具有一定的孔徑，對(duì)通過(guò)的分子大小有一定的選擇性。在透析過(guò)程中，大分子蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜而滯留在透析袋內(nèi)，小分子物質(zhì)可以自由進(jìn)出透析袋，直到它們?cè)谕肝龃鼉?nèi)外的濃度達(dá)到平衡。透析時(shí)需反復(fù)更換透析液，使小分子物質(zhì)較完全地除去。透析過(guò)程中可測(cè)定透析外液中的某種小分子的濃度，以檢查透析結(jié)果。第19頁(yè)/共46頁(yè)

超濾法是利用高壓力或離心力，使水和其他小分子的溶質(zhì)快速通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)則留在膜內(nèi)，從而分離、濃縮了蛋白質(zhì)。該法縮短了操作時(shí)間?？蛇x擇不同孔徑的濾膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。（2）離心分離：依據(jù)蛋白質(zhì)分子量、形態(tài)和質(zhì)量的不同，它們?cè)陔x心力場(chǎng)中表現(xiàn)出不同的沉降速度，使蛋白質(zhì)混合物得到初步分離。第20頁(yè)/共46頁(yè)

①差速離心法：逐步分級(jí)加大離心力開(kāi)始用較低的速度離心，使可溶部分和不溶部分分開(kāi)。取上清液加大離心速度，使某些沉降系數(shù)大的物質(zhì)沉淀，其他物質(zhì)仍保留在溶液中。再次取上清液，再加大離心力，又使一些物質(zhì)沉淀，如使反復(fù)多次，可將混合物中不同的物質(zhì)逐級(jí)分開(kāi)。但分辨率較低，僅適用于粗提或濃縮。②等密度梯度離心：根據(jù)物質(zhì)密度的大小在離心管中造成一個(gè)密度梯度環(huán)境，使分離物在離心力的作用下，各自停留在其密度相同的區(qū)域，從而達(dá)到分離的目的。常用的離心介質(zhì)有蔗糖、聚蔗糖、氯化鉑、溴化鉀、碘化鈉等。第21頁(yè)/共46頁(yè)3．凝膠過(guò)濾：分子篩層析這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。凝膠顆粒是一類(lèi)具有三維多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，蛋白質(zhì)混合物中因各分子大小不同而被“篩”阻，使之分離。被分離的蛋白質(zhì)分子量應(yīng)在凝膠工作的范圍內(nèi)，選擇不同分子量的凝膠可用于脫鹽、分離蛋白質(zhì)等。最常用的填充材料是葡聚糖凝膠（sephadexgel）。第22頁(yè)/共46頁(yè)（1）鹽析法：

中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，大量的鹽離子可和蛋白質(zhì)離子競(jìng)爭(zhēng)溶液中的水分子，從而降低了蛋白質(zhì)分子的水合程度，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析。鹽析時(shí)溶液pH靠近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)效果更好。2、根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同分離的方法

由于各種蛋白質(zhì)親水程度不同，故調(diào)節(jié)中性鹽的濃度可使蛋白質(zhì)分段沉淀。第23頁(yè)/共46頁(yè)

常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。應(yīng)用最多是硫酸銨，其優(yōu)點(diǎn)是溶解度大（25℃時(shí)飽和度為4.1mol／L，即767g／L），在這溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)都可以鹽析出來(lái)；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5—5.5之間。影響鹽析的因素：①溫度：溫度低蛋白質(zhì)溶解度降低。除個(gè)別蛋白質(zhì)需在4℃外均可在室溫進(jìn)行操作。②PH：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低。③蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，被沉淀的目的蛋白質(zhì)中常夾雜其他蛋白質(zhì)一起沉淀（共沉淀現(xiàn)象），因此鹽析前需加生理鹽水稀釋?zhuān)沟鞍踪|(zhì)含量在3％左右。第24頁(yè)/共46頁(yè)

（2）等電點(diǎn)沉淀法：蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)狀態(tài)時(shí)靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有所差別，可調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，常與鹽析法結(jié)合用。

（3）有機(jī)溶劑沉淀法：某些有機(jī)溶劑（如甲醇、乙醇或丙酮等）能使蛋白質(zhì)脫水，降低蛋白質(zhì)的溶解度，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子之間的作用力使之析出沉淀，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)易變性，需在低溫下進(jìn)行。不同蛋白質(zhì)的沉淀所需的有機(jī)溶劑濃度不同，選用適當(dāng)濃度的有機(jī)溶劑可以粗分蛋白質(zhì)的組分。第25頁(yè)/共46頁(yè)（4）某些蛋白質(zhì)沉淀劑的作用：有些離子型的表面活性劑、生物堿或酸類(lèi)試劑，可以通過(guò)改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)使其沉淀下來(lái)。例如：苦味酸、鎢酸、三氯醋酸等含多價(jià)離子，能中和蛋白質(zhì)分子的大部分電荷，并和蛋白質(zhì)形成復(fù)合物共同沉淀下來(lái)。還有一些水溶性非離子聚合物，例如：右旋糖苷硫酸鈉、聚乙二醇(PEG)也能引起蛋白質(zhì)的沉淀。第26頁(yè)/共46頁(yè)3、根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)分離的方法根據(jù)蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開(kāi)。（1）電泳法：各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同得以分開(kāi)。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí)，到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止。第27頁(yè)/共46頁(yè)

（2）離子交換層析法：離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑，當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度的方法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。4、根據(jù)配體特異性分離的方法——親和層忻法親和層析法是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，而且純度很高。第28頁(yè)/共46頁(yè)

這種方法根據(jù)某種蛋白質(zhì)能與一種稱(chēng)為配體(1igand)的分子特異、非共價(jià)結(jié)合而被吸附在親和層析柱上，后可通過(guò)改變緩沖液的離子強(qiáng)度和pH的方法，將該蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，也可用更高濃度的同一配體溶液或親和力更強(qiáng)的配體溶液洗脫。親和層析具有特異性強(qiáng)、結(jié)合效率高、分離速度快的特點(diǎn)?？膳c超濾結(jié)合起來(lái)，將兩者優(yōu)點(diǎn)集中組成超濾親和純化，形成高分離效率和大規(guī)模工業(yè)化的優(yōu)勢(shì)，用于初分離。配體可以是酶的底物、抑制劑、輔因子、特異性的抗體等。第29頁(yè)/共46頁(yè)五、樣品的濃縮、干燥及保存（一）樣品的濃縮生物大分子在制備過(guò)程中由于純化而使樣品變得很稀，為了保存和鑒定，往往需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法有：1．減壓加溫蒸發(fā)濃縮法：通過(guò)降低液面壓力使液體沸點(diǎn)降低，減壓的真空度愈高，液體沸點(diǎn)降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。第30頁(yè)/共46頁(yè)2．空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮：

空氣的流動(dòng)可使液體加速蒸發(fā)。如將樣品溶液裝入透析袋置于冷室，用電扇對(duì)準(zhǔn)吹風(fēng)，使溶劑不斷蒸發(fā)，而達(dá)到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。3．冰凍法：將待濃縮樣品放在低溫結(jié)成冰（鹽類(lèi)及生物大分子不易結(jié)冰內(nèi)而留在液相中），然后緩慢地溶解，利用溶劑與溶質(zhì)熔點(diǎn)的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。例如：蛋白質(zhì)的鹽溶液用此法濃縮時(shí)，不含蛋白質(zhì)的冰結(jié)晶浮于液面，蛋白質(zhì)集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)的濃縮液。第31頁(yè)/共46頁(yè)4．吸收法：通過(guò)吸收劑直接吸收除去溶液使之濃縮。所用的吸收劑必須與溶液不起化學(xué)反應(yīng)，對(duì)生物大分子不吸附，易與溶液分開(kāi)。常用的吸收劑有聚乙二醇、聚乙烯吡絡(luò)酮、蔗糖和凝膠等。使用聚乙二醇吸收劑時(shí)，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外加聚乙二醇覆蓋置于4℃下，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達(dá)到所需要的濃縮程度。第32頁(yè)/共46頁(yè)5．超濾法：液體在一定壓力(氮?dú)鈮夯蛘婵毡脡?下通過(guò)超濾膜時(shí)，溶劑和小分子透過(guò)，大分子受阻而保留。該法適于蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，它具有成本低、操作方便、條件溫和、能較好地保持生物大分子的活性、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用超濾法要注意膜的選擇，不同類(lèi)型和規(guī)格的膜水的流速、分子量截止值等參數(shù)均不同，必須根據(jù)實(shí)際需要來(lái)選用。超濾裝置形式、溶質(zhì)成分及性質(zhì)、溶液濃度等對(duì)超濾的效果有一定影響。如用超濾膜制成的纖維管超濾透析法，由于透析面積增大，因而使透析時(shí)間縮短了10倍。第33頁(yè)/共46頁(yè)（二）干燥生物大分子制備得到的產(chǎn)品，為防止變質(zhì)，易于保存，常需要干燥處理，最常用的方法是真空冷凍干燥。在相同壓力下，水蒸氣壓力隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰易升華。操作時(shí)先將待干燥的液體冷凍到冰點(diǎn)以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干燥后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，適用于各類(lèi)生物大分子的干燥保存。第34頁(yè)/共46頁(yè)（三）貯存生物樣品的穩(wěn)定與保存方法有很大的關(guān)系。

干燥制品比較穩(wěn)定，在低溫情況下其活性可保存數(shù)年，只要將樣品置于干燥器內(nèi)貯藏于0℃-4℃冰箱即可。

液態(tài)貯藏應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：1．樣品不能太稀，樣品太稀易變性。故須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，2．需加防腐劑和穩(wěn)定劑，常用防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等。酶類(lèi)可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。3．貯藏溫度大多數(shù)在0℃，有的則要求更低，視不同物質(zhì)而定。第35頁(yè)/共46頁(yè)

第二節(jié)蛋白質(zhì)的含量測(cè)定在蛋白質(zhì)的分離純化的過(guò)程中，經(jīng)常需要測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。臨床上診斷疾病和觀察病程，也往往需要測(cè)定體液中蛋白質(zhì)的含量。因此蛋白質(zhì)含量的測(cè)定是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究的重要基礎(chǔ)工具，在實(shí)際工作中具有重要的意義。下面介紹蛋白質(zhì)含量測(cè)定常用的方法。第36頁(yè)/共46頁(yè)一、凱氏定氮法

1883年丹麥化學(xué)家Kjeldahl建立，后經(jīng)不斷改良，使之在精確性、敏感性和操作的簡(jiǎn)便程度上不斷改進(jìn)，至今凱氏定氮法仍然是建立各個(gè)具體方法時(shí)采用的參考標(biāo)淮方法。其基本原理：生物樣品與濃硫酸一起加熱消化，其中含氮化合物被分解并轉(zhuǎn)化為硫酸銨；再與氫氧化鈉作用使氨釋出，釋出的氨用硼酸吸收生成硼酸銨，再用標(biāo)準(zhǔn)硫酸滴定，求出生物樣品中氮的含量。根據(jù)蛋白質(zhì)平均含氮量為16％，用氮的含量乘以6.25即可算出蛋白質(zhì)的含量。第37頁(yè)/共46頁(yè)

凱氏定氮法的優(yōu)點(diǎn)是適用于一切樣品的測(cè)定。可用于動(dòng)、植物的各種組織、器官以及食品、土壤等成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)的含量測(cè)定。尤其是樣品溶液渾濁，用其他方法不能測(cè)定，采用凱氏法可以獲得可靠的結(jié)果。主要缺點(diǎn)是：①樣品中的非蛋白氮使測(cè)定值偏高，因此測(cè)定前需除去與樣品共存的非蛋白氮。②含堿性氨基酸、酰胺和小分子量氨基酸(甘氨酸、丙氨酸等)偏多的蛋白質(zhì)含氮量明顯高于理論含氮量，造成測(cè)定結(jié)果偏高；③操作過(guò)程繁瑣，對(duì)操作者的技術(shù)熟練程度要求高，易受實(shí)驗(yàn)室空氣中氨含量的影響。第38頁(yè)/共46頁(yè)二、雙縮脲法雙縮脲比色法是目前最常用的蛋白質(zhì)定量方法。其原理是Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵絡(luò)合，形成紫紅色絡(luò)合物，此物質(zhì)可540nm比色測(cè)定，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸組成無(wú)關(guān)。此法常用于0.5g/L-10g／L蛋白質(zhì)溶液的測(cè)定。其優(yōu)點(diǎn)在于核酸、硫酸銨等其它非蛋白質(zhì)成分不干擾顯色，在提純?cè)缙陔A段復(fù)雜生物體系中快速測(cè)定其中蛋白質(zhì)的含量非常有用。

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為提高靈敏度發(fā)展了微量雙縮脲法。此法顯色原理與雙縮脲法相同，用310nm進(jìn)行比色測(cè)定。

其缺點(diǎn)是特異性不強(qiáng)，凡分子中含兩個(gè)以上的-CO-NH2鍵化合物，均可與堿性銅溶液作用形成紫色化合物，影響測(cè)定結(jié)果。第40頁(yè)/共46頁(yè)三、福林酚試劑法原理：酚試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸可與蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸的酚羥基作用，失去氧原子形成還原型的混合酸。在堿性環(huán)境中烯醇化的肽與銅離子絡(luò)合，絡(luò)合銅再與還原型的混合酸進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生深藍(lán)色化合物(鉑藍(lán)和鎢藍(lán)混