蛋白質(zhì)研究技術(shù)

蛋白質(zhì)研究技術(shù)第1頁/共58頁一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的兩性電離第2頁/共58頁蛋白質(zhì)分子顆粒大小1~100nm之間,屬膠體顆粒范圍蛋白質(zhì)的膠體原因：

表面形成水化層

表面同種電荷的斥力

蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體第3頁/共58頁

當(dāng)破壞了維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋白質(zhì)的構(gòu)象時，蛋白質(zhì)就會從溶液中析出，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀(一)蛋白質(zhì)的沉淀概念:

應(yīng)用:(1)

蛋白質(zhì)分離純化

(2)解毒

(3)臨床檢驗

第4頁/共58頁

蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀1、高濃度中性鹽（鹽析、鹽溶）；2、酸堿（等電點(diǎn)沉淀）；3、有機(jī)溶劑沉淀；4、重金屬鹽類沉淀；5、生物堿試劑沉淀6、加熱變性沉淀第5頁/共58頁(1)鹽析法(saltingout)

常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等

使蛋白質(zhì)沉淀的方法

概念：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀稱為鹽析

特點(diǎn)：不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象，蛋白質(zhì)不發(fā)生變性

作用原理:

鹽離子與水親和力極強(qiáng)，奪去蛋白質(zhì)的水化層，減少分子間靜電斥力第6頁/共58頁(2)有機(jī)溶劑沉淀法

注意事項:

必須在低溫下操作盡量縮短處理的時間及時將蛋白質(zhì)中殘存的有機(jī)溶劑除去

缺點(diǎn)：常會使蛋白質(zhì)變性常會使蛋白質(zhì)變性

原理:

使蛋白質(zhì)脫去水化層,又能降低溶液的介電常數(shù)使蛋白質(zhì)表面電荷減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀

常用有機(jī)溶劑：甲醇、乙醇、丙酮

第7頁/共58頁(3)重金屬鹽沉淀法

若溶液pH大于蛋白質(zhì)的pI，沉淀更易發(fā)生

缺點(diǎn)：此法常使蛋白質(zhì)變性失活

原理:

重金屬離子如Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+

等帶有正電荷，能與蛋白質(zhì)分子中帶負(fù)電的基團(tuán)結(jié)合，生成不溶性的重金屬蛋白鹽而沉淀第8頁/共58頁(4)生物堿試劑和某些酸類沉淀法

缺點(diǎn)：常引起蛋白質(zhì)變性

原理:

生物堿試劑(如鞣酸、苦味酸、鎢酸等)，某些酸類(主要是指三氯醋酸、磺酰水楊酸和硝酸等)，與帶正電的蛋白質(zhì)結(jié)合生成不溶性的鹽而沉淀

注意事項:

反應(yīng)溶液的pH<pI，確保蛋白質(zhì)以陽離子形式存在

等電點(diǎn)沉淀：pH=pI時引起蛋白質(zhì)的沉淀第9頁/共58頁(二)蛋白質(zhì)的凝固概念：變性蛋白質(zhì)互相凝聚或互相穿插在一起的現(xiàn)象稱蛋白質(zhì)的凝固，凝固作用本質(zhì)上是蛋白質(zhì)變性后進(jìn)一步發(fā)展的不可逆結(jié)果如加熱可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴荒茉偃芙獾哪龎K第10頁/共58頁超濾：利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小分子雜質(zhì)通過超濾膜(一種半透膜)除去，而蛋白質(zhì)留在膜上，稱為超過濾透析：將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜的袋內(nèi)，置于流動的適當(dāng)?shù)木彌_液（如純水）中，小分子雜質(zhì)（如硫酸銨、氧化鈉等）從袋中透出，而蛋白質(zhì)保留于袋中從而將蛋白質(zhì)純化（三）透析和超濾第11頁/共58頁透析工作圖半透膜原理磁力攪拌器透析袋第12頁/共58頁超濾工作圖第13頁/共58頁(四)電泳

概念：帶電顆粒在電場中向著所帶電荷相反方向移動的現(xiàn)象原理：不同的蛋白質(zhì)的因結(jié)構(gòu)、形狀和帶電量的不同而有不同的泳動速度，從而達(dá)到分析和分離蛋白質(zhì)的目的應(yīng)用：電泳技術(shù)是生化常用分析技術(shù)之一

第14頁/共58頁(四)電泳

分類：自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn)

行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域

-紙電泳：用濾紙作為支持物

-凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物

圓盤電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳

平板電泳：在鋪有凝膠的玻板上進(jìn)行的電泳

第15頁/共58頁+

——+圓盤電泳平板電泳第16頁/共58頁(四)電泳

電泳的應(yīng)用：蛋白質(zhì)分子量的測定：SDS,Native蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定：

IsoelectricFocusing

蛋白質(zhì)組學(xué)研究：雙向電泳

第17頁/共58頁樣品處理染色電泳蛋白質(zhì)分子量的測定（SDS

）(四)電泳

第18頁/共58頁(四)電泳

蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定第19頁/共58頁等電聚焦第二相電泳染色

主要用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究蛋白質(zhì)雙向電泳(2D)(四)電泳

第20頁/共58頁(五)層析原理：溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為存在差別，從而導(dǎo)致移動速度的不同

離子交換色譜(ionexchangechromatography)

疏水作用色譜(hydrophobicchromatography)

凝膠過濾色譜(gelfiltrationchromatography)

親和色譜(affinitychromatography)

金屬螯和色譜(metalchelatingchromatography)

第21頁/共58頁離子交換色譜原理：根據(jù)離子交換樹脂對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離的目的，大分子因與樹脂親和力不同，以不同牢度被吸附于離子交換劑，通過改變離子強(qiáng)度或(和)pH使大分子從樹脂上先后被洗脫

分為：陰離子交換基：DEAE（二乙胺乙基）

QAE（季銨乙基）

陽離子交換基：

CM（羧甲基）

P（磷酸基）

SP（磺丙基）第22頁/共58頁實(shí)驗條件的選擇2468101214等電點(diǎn)-體系

pH蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷+蛋白質(zhì)帶正電荷

根據(jù)蛋白的性質(zhì)選擇適宜的pH值和緩沖體系0第23頁/共58頁實(shí)驗條件的選擇P+P0P-P2-P3-P3-P2-P-P+P0P3-P2-P-P+P0

根據(jù)蛋白的性質(zhì)選擇合適的洗脫條件第24頁/共58頁疏水作用色譜原理：根據(jù)蛋白質(zhì)與吸附劑之間的弱疏水性作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)的分步洗脫各種凝膠過濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑常用的疏水性配基：苯基、短鏈烷基C3~C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚疏水吸附作用與配基的疏水性（疏水鏈長度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異，過小則疏水性吸附作用不足，過大則洗脫困難第25頁/共58頁

疏水作用色譜的洗脫一般采用降低緩沖液中的鹽濃度來洗脫蛋白也可以采用加入少量的有機(jī)溶劑來洗脫，如反相色譜疏水作用色譜Fraction第26頁/共58頁凝膠過濾色譜概念：

當(dāng)生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)，又可稱作排阻色譜或者分子篩色譜原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來常用凝膠：交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex)

、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠（Sepharose）第27頁/共58頁凝膠過濾色譜的洗脫第28頁/共58頁凝膠過濾色譜的應(yīng)用生物大分子的分離純化分子量的測定分級分離溶液濃縮平衡常數(shù)的測定細(xì)胞及顆粒的分離第29頁/共58頁親和色譜原理：利用化學(xué)方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異結(jié)合的化合物（稱配體）連接到固相載體上，當(dāng)待提純的生物大分子通過此層析柱時，可以與載體上的配體特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)則不能結(jié)合，然后用適當(dāng)方法使生物大分子從配體上洗脫下來，從而達(dá)到分離提純的目的

特點(diǎn)：純化效率高，提純度可達(dá)幾千倍第30頁/共58頁配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物交聯(lián)試劑載體配體載體與配體交聯(lián)體雜質(zhì)雜質(zhì)游離配體洗脫結(jié)合耦聯(lián)作用機(jī)理第31頁/共58頁親和色譜的洗脫第32頁/共58頁親和色譜的應(yīng)用

抗原和抗體

激素和受體蛋白

凝集素和多糖(糖蛋白)

酶與輔酶(或產(chǎn)物、抑制劑)

核酸與互補(bǔ)鏈（或核酸多聚酶、結(jié)合蛋白）

細(xì)胞與細(xì)胞表面特異蛋白（或凝集素）第33頁/共58頁金屬螯合色譜原理：利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進(jìn)行分離NH2NH2NiHisHisHisHisprotein第34頁/共58頁特點(diǎn)：體系復(fù)雜:含量低、組分多、干擾大水溶液體系：接近生理狀態(tài)，盡量避免使用有機(jī)溶劑低溫操作：防止蛋白變性和失活必要的添加劑：蛋白酶抑制劑、還原劑專業(yè)的儀器設(shè)備：制備型蛋白質(zhì)分離、純化和鑒定第35頁/共58頁蛋白質(zhì)分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)分離提純的原則：

純度、活性和產(chǎn)量蛋白質(zhì)分離提純的一般步驟：

破碎細(xì)胞→蛋白提取→粗細(xì)分級→鑒定分離純化技術(shù)

綜合運(yùn)用各種方法和技術(shù)第36頁/共58頁蛋白質(zhì)分離純化方法按蛋白質(zhì)性質(zhì)分類

溶解度：沉淀(鹽析、有機(jī)溶劑、等電點(diǎn))

分子大小、形狀：離心、超濾、透析、凝膠過濾層析

分子大小、電荷：電泳、離子交換層析

分子間作用力：親和層析、金屬鰲合層析、疏水作用層析第37頁/共58頁蛋白質(zhì)分離純化方法按純化方法分類

沉淀：鹽析、有機(jī)溶劑、等電點(diǎn)

電泳：凝膠電泳、等電聚焦

離心：常規(guī)、密度梯度

過濾：超濾、透析

層析：離子交換、凝膠過濾、親和層析、疏水作用第38頁/共58頁蛋白分離純化的目的

活力的生化分析

蛋白的翻譯后修飾（Post-translationalmodifications)相互作用和蛋白的裝配(Interactionsandassembly)三維結(jié)構(gòu)(3-dimensionalstructure)生物功能分析(Analysisofbiologicalfunction)藥物開發(fā)(Drugdevelopment)……第39頁/共58頁

從有機(jī)體中獲得純的蛋白要盡可能的用較少的步驟，盡可能少的丟失活力分離純化策略第40頁/共58頁

細(xì)胞與組織(材料來源有限，但是蛋白是天然的狀態(tài))—折疊均一,可溶（主要指非膜蛋白）—可通過差速離心分離細(xì)胞組份—純化可用色譜方法（chromatography）從哪兒開始？第41頁/共58頁

cDNA克?。槟壳暗鞍讈碓吹闹饕椒?，但是蛋白易形成包涵體（inclusionbody））

—

重組蛋白基因在大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞或植物細(xì)胞中表達(dá)

—也用差速離心及色譜方法純化

—在重組的蛋白中可以添加‘Tags’以便于純化從哪兒開始？第42頁/共58頁破碎細(xì)胞上清

沉淀(丟棄)離心細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解物,蛋白核酸及小分子

多步純化(包括鹽析、過濾、層析等)不需要的分子

純蛋白從組織細(xì)胞中進(jìn)行蛋白分離流程圖第43頁/共58頁蛋白質(zhì)粗分離I：從組織細(xì)胞

--提取哪個物種合適？

豐度及活力特點(diǎn)

大小，成本及物種的可獲得狀況哪個組織合適?

對于特定的細(xì)胞哪個組織豐富

組織中哪種細(xì)胞中有這類蛋白

純化過程中的作為應(yīng)該與特定的方案相關(guān)非常有益的信息

大小、組成第44頁/共58頁影響組織提取的因素

緩沖液（Buffer）離子強(qiáng)度（Inoicstrength）金屬離子螯合劑（Metalionchelators）還原劑（Reducingagents）蛋白酶抑制劑（Proteaseinhibitors）溫度（Temperature）組織的破碎方式（Tissuedisruption）第45頁/共58頁組織破碎

(Tissuedisruption)

除去不要的組織攪碎勻漿（homogenization）研磨(vesselforextraction)第46頁/共58頁細(xì)胞破碎

(CellDisruption)

化學(xué)破碎:堿、有機(jī)溶劑、去污劑酶學(xué)手段:溶菌酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶

(常適用于含細(xì)胞壁的細(xì)菌及植物細(xì)胞)

物理方法:滲透壓震蕩、凍溶機(jī)械方法:超聲、勻漿、濕磨、壓力第47頁/共58頁初步純化

--熱變性

不同的蛋白有不同的熱穩(wěn)定性，且有些蛋白可以在熱變性以后再復(fù)性

鈣調(diào)蛋白是能通過熱變性而獲得純化的一個很好例子天然結(jié)構(gòu)(%)一般蛋白0(℃)100鈣調(diào)蛋白第48頁/共58頁初步純化

--沉淀鹽析：減少蛋白質(zhì)表面的水化層硫酸銨、尿素等電點(diǎn)沉淀：降低蛋白質(zhì)分子的荷電狀態(tài)改變體系pH值至pI附近有機(jī)溶劑沉淀：減少蛋白表面水化層，增加疏水性降低水的介電常數(shù)，降低蛋白溶解性甲醇、乙醇、丙酮、聚乙二醇第49頁/共58頁蛋白質(zhì)粗分離II：表達(dá)蛋白

重組基因的表達(dá)

可獲得大量的蛋白

可進(jìn)行突變-structure/activitystudies

可引入具有光譜特性的物質(zhì)

可引入穩(wěn)定同位素