分子診斷學遺傳性疾病的分子診斷

分子診斷學遺傳性疾病的分子診斷第1頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一Therearemanydifferenttechniquesthatcanbeusedtodiagnosetheglobingenemutations,includinggap-PCR,ARMS-PCR,andREanalysisofamplifiedproduct.globin：球蛋白KeyPoints第2頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一HemophiliaisacongenitaldiseaseofthecoagulationdisorderswhichconstituterecessivedisorderslinkedtochromosomeX.ThestudywascarriedoutbytheSSCP,RELP,Southernblot,VNTR,andSTR.

hemophilia：血友??；congenitaldisease：先天性疾??；coagulation：凝固，凝結(jié)；recessive：隱性第3頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一TwomultiplexPCRsareconstructedinwhich9exonscanbeamplifiedsimultaneously,and98%ofalldeletionscanbeidentified.multiplex：多樣化；exon：外顯子；simultaneously：同時地；deletion：缺失第4頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一Phenylketonuriaisaninbornerrorofmetabolismresultingfromadeficiencyofphenylalaninehydroxylase.Therearemanytechniquesthatcanbeusedtomutationscreening,suchasPCR-STR,PCR-SSCP,PCR-RFLP,PCR-DGCE,andsoon.

Phenylketonuria：苯丙酮尿phenylalaninehydroxylase：苯基丙氨酸羥化酶第5頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一Cysticfibrosis(CF)iscausedbymutationsintheCFTRgene.Fivetestsaremostfrequentlyused:resctrictionenzymeanalysis,theheteroduplexanalysis,ARMS,reversehybridizationandOLA.Cysticfibrosis：囊胞性纖維癥heteroduplex：異源雙鏈核酸分子Hybridization：雜交第6頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一Huntington’sdisease(HD)involvesapolymorphic(CAG)repeatsequencelocatedinexon1oftheIT15geneat4p16.3.HDcanbeaccuratelyconfirmedorexcludedbyPCR-basedassay.Huntington’sdisease(HD)：亨廷頓病第7頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一FragileXdiseaseresultsfromtrinucleotide(CGG)repeatexpansions.Atpresent,diagnosticproceduresoffragileXdiseasearebasedonSouthernblottingandonPCRamplification.

FragileXdisease：脆性X綜合征trinucleotide：三核苷酸第8頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一TwomajortechnologiesareinuseforPNDandPGD:PCRformonogenicdiseasesandFISHforchromosomalaberrations.

monogenic：單基因的第9頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一遺傳性疾病的分子診斷（moleculardiagnosisofgeneticdisease）是指通過分析患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達水平的變化，對人體健康狀態(tài)和疾病做出或輔助診斷的方法。第10頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一評估基因的存在和缺陷通常以DNA為材料評估基因的表達量則以基因轉(zhuǎn)錄或翻譯RNA/蛋白質(zhì)為對象第11頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一Section1遺傳性疾病分子診斷的策略所有遺傳性疾病都與某種或多種基因的突變有關?；蛲蛔兊母拍睿哼z傳物質(zhì)的各種遺傳性改變稱基因突變（mutation），其實質(zhì)是核苷酸的增添、缺失、替代、顛倒和轉(zhuǎn)位。第12頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一自然條件自發(fā)突變?nèi)藶楦深A誘發(fā)突變攜帶突變的生物個體或群體稱為突變體（mutant）對遺傳性疾病的分子診斷有三種策略可供選擇：1.直接診斷策略；2.基因多態(tài)性連鎖分析；3.基因突變的定量第13頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一直接診斷策略通過分子生物學技術直接檢測導致遺傳性疾病的各種基因突變。因此其前提是被測基因已經(jīng)被克隆，其核酸序列和機構(gòu)已被闡明。點突變的診斷：即DNA分子中的一個堿基被另一個堿基所替換，其后果取決于替換的性質(zhì)和位置第14頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一點突變背景清楚或部分清楚：allelespecificoligonucleotide,ASO、PCR-ELISA、allelespecificamplification,ASA、PCR-RFLP、基因芯片點突變背景未知：single-strandconformationalpolymorphism,SSCP、denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE、heteroduplexanalysis,HA、DNA序列測定、proteintruncationtest,PTT第15頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一片段性突變的檢測：指DNA分子中較大范圍的堿基發(fā)生突變方法：Southernblotting、多重PCR第16頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一基因多態(tài)性連鎖分析間接診斷，在家系中進行連鎖分析和關聯(lián)分析單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）,第3代遺傳標記第17頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一第18頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一基因突變的定量診斷第19頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一Section2遺傳病的分子診斷血紅蛋白病血紅蛋白病（hemoglobinopathy,Hb）是由于編碼血紅蛋白的基因異常而發(fā)生的一類遺傳性貧血病。第20頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一主要分為兩大類：異常血紅蛋白病，Hb發(fā)生結(jié)構(gòu)上的異常，導致貧血病，例如鐮刀狀細胞貧血第21頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一地中海貧血，構(gòu)成Hb的蛋白部分-珠蛋白的合成降低或消失，也稱珠蛋白合成障礙性貧血第22頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一第23頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一α珠蛋白基因&β珠蛋白基因第24頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一鐮刀狀細胞貧血（sicklecellanemia）鐮刀狀細胞貧血的分子機制第一個成功在分子水平得以解釋的人類疾病第25頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一第26頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一鐮刀狀細胞貧血的分子診斷方法最常用的是限制性內(nèi)切酶法（RE）第27頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一地中海貧血（thalassemia）由于珠蛋白基因缺失或突變導致某種珠蛋白鏈合成速率降低，造成α鏈和非α鏈合成不均衡，引起溶血性貧血。按照合成速率降低的珠蛋白類型分為α、β、γ、δ地中海貧血第28頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一α-地中海貧血（α-thalassemia）α0地貧是α鏈完全不能合成者α+地貧是部分α鏈合成者HbBartˊs水腫綜合征HbF為α2γ

2α鏈減少形成γ

4聚體HbH病HbA為α2β2α鏈減少,形成β4聚體具有較高的氧的親合力，使組織供氧不足導致貧血第29頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一α地中海貧血的分子機制缺失型α+地貧α0地貧1）α+地貧：左側(cè)缺失：α2基因右側(cè)缺失：α2基因3ˊ端和α1基因5ˊ端構(gòu)成融合基因第30頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一2)α0地貧①缺失α珠蛋白到α1基因5ˊ端缺25kb②只有ζ基因缺17.4kb

③ζ和Ψζ基因缺17.5kb

④

缺失α2基因和α1基因5ˊ端缺5.2kb第31頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一第32頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一3）非缺失型α地貧中國人非缺失型HbH病病因：α2基因的125位密碼子CTG（亮）突變CCG（脯),妨礙α1β1二聚體的形成，導致貧血分子診斷方法PCR法、ARMS法、ASA法、SSCP法、等位基因特異性擴增技術（ASPCR）法

第33頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一1）重型β地中海貧血：β0/β0

和β0/β+β鏈合成減少，γ鏈合成增加，HbF對氧親和力高，是組織缺氧2）輕型β地中海貧血：β0/βA

和β+/βA3）δβ地中海貧血：β和δ基因缺失導致β鏈、δ鏈不能合成β地中海貧血是β珠蛋白基因突變和部分缺失導致β鏈合成速率降低。第34頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一β地中海貧血的分子診斷方法PCR-RDB法、PCR-ASO法、ASPCR法、突變寡核苷酸延伸擴增PCR（mutantoligonucleotideextentionamplification,MOEA）法、多重等位基因特異PCR（multiplexallelespecificPCR，MAS-PCR）法、基因芯片法第35頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一血友?。╤emophilia）多數(shù)凝血因子是蛋白質(zhì)，由其有關的基因編碼。由于這些基因的缺陷而使其中某一凝血因子蛋白表達降低或缺失即造成血友病第36頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一甲型血友病概念：抗血友病球蛋白（antihemophilicglobulin,AHG)遺傳性缺乏所致臨床表現(xiàn)：出血不止分子基礎：FⅧ

由26個外顯子（9kb）25個內(nèi)含子（177kb）編碼2351個氨基酸第37頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一第38頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一分子診斷方法：基因倒位檢測和非基因倒位檢測基因倒位檢測：LD-PCR（長距離PCR）非基因倒位檢測：PCR-RFLP法、VNTR法、STR法、PCR-SSCP法第39頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一乙型血友病概念：凝血因子Ⅸ

即血漿凝血活成分（PTC）遺傳性缺乏臨床表現(xiàn)：出血部位：肌肉、關節(jié)、深部組織分子基礎：FⅨ，長度34kb，8個外顯子和7個內(nèi)含子以及側(cè)翼順序中調(diào)控區(qū)域構(gòu)成第40頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一分子診斷方法：直接和間接方法檢測直接檢測方法：直接測序法、基因芯片法和毛細管電泳間接檢測方法：RFLP法、SSCP法、DGGE法、雙脫氧指紋圖譜、變性高效液相色譜法第41頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一肌營養(yǎng)不良癥（hemophilia）主要有杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchennemusculardystrophy,DMD）和貝氏營養(yǎng)不良癥（Beckermusculardystrophy,BMD）發(fā)病機制：抗肌萎縮蛋白基因的突變導致肌細胞膜上的抗肌萎縮蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變所致第42頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一第43頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一抗肌萎縮蛋白基因：DMD基因包括79個外顯子和78個內(nèi)含子，全長約2.3×106bp，是目前已知人類最大的基因分子診斷方法：多重PCR技術第44頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一第45頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一短串聯(lián)重復序列（shorttandemrepeat,STR）連鎖分析定量PCR技術RT-PCR技術第46頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一苯丙酮尿癥（phenylketonuria,PKU）主要是由于肝內(nèi)苯丙氨酸羥化酶（phenylalaninehydroxylase,PAH）嚴重缺失所致的苯丙氨酸代謝異常，為常染色體隱性遺傳病臨床表現(xiàn)：智力障礙、色素減少、尿特殊氣味及神經(jīng)和精神癥狀第47頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一第48頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一分子診斷方法：PCR-STR連鎖分析PCR-RFLP多重ASPCR法PCR-DGGE法第49頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一囊性纖維化（cysticfibrosis,CF）由囊性纖維化穿膜傳導調(diào)節(jié)因子（cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator,CFTR）基因突變所致臨床表現(xiàn)：極易發(fā)生呼吸道感染而引起氣道梗阻及呼吸功能不全，多數(shù)患者僅能成活數(shù)年到10余年第50頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一第51頁，共57頁，2023年，2月20日，星期一分子診斷方法：P