動(dòng)物組織培養(yǎng)演示文稿

動(dòng)物組織培養(yǎng)演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)第二章動(dòng)物組織培養(yǎng)目前二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)第一節(jié)概述

一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展歷史二、動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的基本概念

三、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的特點(diǎn)

四、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的一般條件(掌握）

五、體外培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性(掌握）目前三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展歷史1885年，WilhelmRoux（勞斯，德國(guó)）最先嘗試離體培養(yǎng)雞胚神經(jīng)存活了一段時(shí)間。并且，他首次采用了“組織培養(yǎng)”一詞。1907年，美國(guó)胚胎學(xué)家RossHarrison（哈里森）培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)出了軸突（蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法）。他被公認(rèn)為動(dòng)物組織培養(yǎng)的開山鼻祖。1912年,法國(guó)學(xué)者AlexisCarrel（卡雷爾）采用雞胚勻漿組織液與血漿混合使用，培養(yǎng)了各種動(dòng)物組織的組織塊。在技術(shù)方面，卡雷爾把無菌操作技術(shù)引入組織培養(yǎng)中。1923年，他設(shè)計(jì)了卡氏培養(yǎng)瓶。目前四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1913年，Steinhardt建立了單蓋片懸滴培養(yǎng)法。1925年，Maximow采用雙蓋片法。1934年，Gey和Lewis用旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)了許多細(xì)胞系。相繼，人們?cè)O(shè)計(jì)了多種類型的培養(yǎng)瓶。1948年，Sanford創(chuàng)立了單層細(xì)胞培養(yǎng)法，建立了各種細(xì)胞系。他還創(chuàng)建了單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)方法。1951年，Pomerat設(shè)計(jì)了細(xì)胞培養(yǎng)灌流小室技術(shù)，使細(xì)胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液環(huán)境中，便于做細(xì)胞顯微攝影和代謝等研究。1951年，厄爾（Earle）發(fā)明了體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的人工合成培養(yǎng)基。目前五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1952年．Gey建立了第一個(gè)人體細(xì)胞系，人體宮頸癌Hela細(xì)胞系。1960年，Barski等人在兩種不同類型的細(xì)胞混合培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)有自發(fā)的融合細(xì)胞。1962年，岡田善雄又發(fā)現(xiàn)了已滅活的仙臺(tái)病毒可以誘發(fā)體內(nèi)艾氏腹水瘤細(xì)胞和非惡性細(xì)胞融合。且融合細(xì)胞染色體丟失，惡性特征受到抑制。目前六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)二、動(dòng)物組織培養(yǎng)的基本概念1、動(dòng)物組織培養(yǎng)從動(dòng)物體內(nèi)提出組織，于模擬體內(nèi)生理環(huán)境等特定的體外條件下，進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之生存并生長(zhǎng)。是動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)。

目前七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)分類：器官培養(yǎng)

組織培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)目前八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、原代培養(yǎng)(PrimaryCulture)：亦稱初代培養(yǎng)，指直接從機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行培養(yǎng)的過程。3．繼代培養(yǎng)（SecondaryCulture）：亦稱傳代培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱繼代培養(yǎng).4、細(xì)胞系(cellline)：由原代細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)初步純化，獲得的以一種細(xì)胞為主、能在體外長(zhǎng)期生存的不均一的細(xì)胞群體，一般為有限細(xì)胞系。5、細(xì)胞株(cellstrain)：細(xì)胞系經(jīng)過克隆或其他方法得到的單一類型的細(xì)胞群體。目前九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)有限細(xì)胞系(infinitedcellline)：不能連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞株。無限細(xì)胞系(finitedcellline)：能夠連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞株，也稱無限系。無限系細(xì)胞大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞。目前十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)

細(xì)胞株、細(xì)胞系的命名：以組織來源定名，如BHK(幼地鼠腎細(xì)胞)以人名定名，如HeLa細(xì)胞以時(shí)間地點(diǎn)來定名，如S7811細(xì)胞系以臨床疾病類型定名，如BALL-1細(xì)胞系(來自B淋巴細(xì)胞急性白血病人白細(xì)胞))目前十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)三、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)。更易受微生物污染（包括細(xì)菌、真菌、病毒、支原體），需要防治污染問題。對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性差，對(duì)環(huán)境極其敏感。包括pH值、溫度等。對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高，除了氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，一般還需要血清。原代細(xì)胞一般繁殖50代左右退化死亡。總之，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)各方面的要求更高，培養(yǎng)難度更大。目前十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)四、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的一般條件1.環(huán)境無毒和無菌

2.適宜的溫度：人和哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞最適溫度均為35－37℃。3.氣體環(huán)境和氫離子濃度：需要一定量的O2和CO2（95％空氣+5%CO2。

4.滲透壓：260－320mOsm/kg適用于大多數(shù)細(xì)胞5.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：六碳糖是主要的能源物質(zhì)，還需要12種基本氨基酸和谷胺酰胺等。目前十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1.環(huán)境無毒和無菌培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。目前十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2.適宜的溫度人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力較對(duì)高溫強(qiáng)，溫度上升不超過39℃時(shí)，細(xì)胞代謝與溫度成正比；人體細(xì)胞在39-40℃1小時(shí)，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)；在40-41℃1小時(shí)，細(xì)胞會(huì)普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；41-42℃1小時(shí)，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個(gè)別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能；當(dāng)溫度在43℃以上1小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。低溫下會(huì)使細(xì)胞代謝速率降低。目前十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)3.氣體環(huán)境和氫離子濃度氣體：需要O2、CO2（95%空氣、5%CO2）氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有O2和CO2。氧氣參與三羧酸循環(huán),產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需用的各種成分。開放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%CO2混合氣體環(huán)境中.CO2既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物,也是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需成分,它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH值.目前十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH為7.2-7.4,偏離這一范圍對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng)。但有一些細(xì)胞也喜歡偏堿環(huán)境中生長(zhǎng)，，每種細(xì)胞都有其最適pH值.當(dāng)pH低于6或高于7.6時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)受到影響，甚至死亡。紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍(lán)紅色--pH7.6，紫色--pH7.8。目前十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)4.滲透壓細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg,可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，滲透壓在260-320mOsm/kg的范圍都適宜。每千克水中所含的毫滲透粒子數(shù)(mOsm/kgH2O)（"毫滲摩爾每千克"）目前十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)5.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在保證細(xì)胞滲透壓的情況下，培養(yǎng)液里的成分要滿足細(xì)胞進(jìn)行代謝所需要的各種營(yíng)養(yǎng)，如包括十幾種必需氨基酸及其他多種非必需氨基酸、維生素、碳水化合物及無機(jī)鹽類等。只有滿足了這些基本條件，細(xì)胞才能在體外正常存活、生長(zhǎng)。目前十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)五、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)（二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型（三）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖過程

目前二十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)貼附和伸展接觸抑制密度抑制目前二十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1、貼附并伸展是多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本生長(zhǎng)特點(diǎn)。貼附底物：其他細(xì)胞、膠原、玻璃或塑料等。一類特殊的促細(xì)胞附著的物質(zhì)（如基膜素、纖維連接素、Ⅲ型膠原、血清擴(kuò)展因子等）可能參加細(xì)胞的貼附過程。培養(yǎng)細(xì)胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)。目前二十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)細(xì)胞貼附和伸展過程：目前二十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)細(xì)胞貼壁過程目前二十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)影響細(xì)胞貼附和伸展的因素：細(xì)胞因素；生物因素（如促附著因子）；機(jī)械、物理因素（如低溫或培養(yǎng)液的流動(dòng)過快)；其它一些因素的影響（例如：離子的作用)。目前二十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、接觸抑制（Contactinhibition）細(xì)胞從接種到長(zhǎng)滿底物表面后，由于細(xì)胞繁殖數(shù)量增多相互接觸后，不再增加。一般的正常細(xì)胞并不互相重疊于其上面而生長(zhǎng)；但是，轉(zhuǎn)化細(xì)胞或癌瘤細(xì)胞則接觸抑制下降，它們互相之間可在上面或下面經(jīng)過而重疊生長(zhǎng)。

目前二十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前二十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前二十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)3、密度抑制（Densityinhibition）3T3細(xì)胞系，在細(xì)胞稀少狀態(tài)下培養(yǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)迅速；但一旦細(xì)胞生長(zhǎng)匯合成一片時(shí)（每6cm培養(yǎng)皿約106個(gè)細(xì)胞），其分裂增殖停止。其確切的細(xì)胞密度常與培養(yǎng)液中的血清濃度有關(guān)。上述這種生長(zhǎng)特性即為密度依賴性調(diào)節(jié)（或密度抑制）。轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞則與正常細(xì)胞不同，他們的密度依賴性調(diào)節(jié)常常降低，因而可以生長(zhǎng)至較高的終末細(xì)胞密度。目前二十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1、貼壁依賴型細(xì)胞2、非貼壁依賴型細(xì)胞成纖維細(xì)胞上皮型細(xì)胞游走型細(xì)胞多形型細(xì)胞（二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞目前三十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（1）成纖維細(xì)胞型：在培養(yǎng)中的細(xì)胞凡形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似時(shí)，皆可稱之為成纖維細(xì)胞。本型細(xì)胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名.除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間質(zhì)起源的組織細(xì)胞常呈本類形態(tài)生長(zhǎng)。人胚肺細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)為典型的成纖維細(xì)胞型。

1、貼壁依賴型細(xì)胞目前三十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)人的成纖維細(xì)胞小鼠的成纖維細(xì)胞人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（MSC）目前三十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前三十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞成纖維細(xì)胞型目前三十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（2）上皮細(xì)胞型此類型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長(zhǎng)具有扁平狀，不規(guī)則。細(xì)胞貼壁后呈不規(guī)則多角形，中央有扁圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層細(xì)胞，呈現(xiàn)“鋪路石狀”。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。內(nèi)胚層和外胚層細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)都可能呈現(xiàn)上皮型。如皮膚、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等。Hela細(xì)胞呈現(xiàn)為典型的上皮細(xì)胞型。目前三十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)單層扁平上皮細(xì)胞人口腔皮樣癌細(xì)胞人宮頸癌上皮細(xì)胞（Hela）目前三十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)成骨肉瘤細(xì)胞(多角形)上皮細(xì)胞型目前三十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)奶牛腎臟上皮細(xì)胞(上皮細(xì)胞型)目前三十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)體外培養(yǎng)時(shí)所謂的上皮細(xì)胞型細(xì)胞或成纖維細(xì)胞型細(xì)胞，僅是因?yàn)槠湫螒B(tài)與體內(nèi)的上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞類似，并不能將體外培養(yǎng)的這些細(xì)胞與體內(nèi)同名的細(xì)胞完全等同；而且，這種名詞系使用于描述細(xì)胞的外形而并非說明細(xì)胞的起源。目前三十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)

（3）游走型細(xì)胞不常見，具有類似巨噬細(xì)胞樣的特征。本型細(xì)胞在支持物上散在生長(zhǎng)，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，速度快且不規(guī)則。此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時(shí)亦難和其它型細(xì)胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細(xì)胞形態(tài)。如單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞中的顆粒型白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。目前四十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)單核巨噬細(xì)胞（未刺激狀態(tài)）游走細(xì)胞型目前四十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)單核巨噬細(xì)胞（活化劑刺激6h后）：向四周伸展偽足目前四十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（4）多形型細(xì)胞形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞，不常見，一般分胞體和胞突兩部分，胞突細(xì)長(zhǎng)形類似絲狀偽足；胞體略呈多角形，但較規(guī)則。如神經(jīng)組織細(xì)胞如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。目前四十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞（DAB顯色）多形型細(xì)胞

神經(jīng)細(xì)胞目前四十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞目前四十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2非貼附型細(xì)胞=懸浮型細(xì)胞：指細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。這種細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)：胞體始終為球形。目前四十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，培養(yǎng)效率高，利于大量生產(chǎn)，與培養(yǎng)基充分接觸無需消化傳代，易于收獲細(xì)胞。缺點(diǎn)：不如貼附生長(zhǎng)型觀察方便，而且并非所有的培養(yǎng)細(xì)胞都能懸浮生長(zhǎng)。貼壁細(xì)胞經(jīng)懸浮適應(yīng)后也可以長(zhǎng)期懸浮培養(yǎng)。目前四十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)實(shí)際情況下，所培養(yǎng)的細(xì)胞并不一定呈現(xiàn)某種典型的形態(tài)，能影響細(xì)胞形態(tài)的因素很多，細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征僅是對(duì)培養(yǎng)物判斷或識(shí)別的一種參考性指標(biāo)，如果想明確某一培養(yǎng)物的確切類型，必須借助于更為特異的鑒定方法。如，Hela細(xì)胞原本是一種上皮型癌細(xì)胞，但在過酸或過堿的條件下培養(yǎng),可以呈現(xiàn)梭形，當(dāng)酸堿度適中時(shí)又可以恢復(fù)上皮型特征。目前四十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（三）體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖過程

1、單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程：

與體內(nèi)細(xì)胞周期相似，經(jīng)歷G1、S、G2、M期。

細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)細(xì)胞分裂時(shí)間為12~48h，細(xì)胞的分裂周期=間期+

分裂期間期（G1+S+G2）分裂期（M）目前四十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前五十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)體外培養(yǎng)細(xì)胞壽命的過程可分為三個(gè)階段:

原代培養(yǎng)期傳代期衰退期2、細(xì)胞系的生長(zhǎng)過程

目前五十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)(1)原代培養(yǎng)（初代培養(yǎng)）為新鮮組織自體內(nèi)取出接種培養(yǎng)至第一次傳代的階段,一般持續(xù)1~4周。特點(diǎn)：原代細(xì)胞培養(yǎng)通常為異質(zhì)性，細(xì)胞獨(dú)立生存性差，多呈二倍體核型，更能代表其來源組織的細(xì)胞類型及組織特異性，是檢測(cè)藥物的很好實(shí)驗(yàn)工具。目前五十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)(2)傳代期當(dāng)細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)增殖一段時(shí)間，達(dá)到一定的細(xì)胞密度后，就應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞分離成兩部分（或更多）至新的培養(yǎng)器皿中，并補(bǔ)充更新培養(yǎng)液，此即為傳代。特點(diǎn):在細(xì)胞整個(gè)生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，一般情況下，可傳代10～50代。細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，被稱為二倍體核型。目前五十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)(3)衰退期此期細(xì)胞雖仍存活，但增殖基本停止，細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生衰退、死亡。細(xì)胞在第二期末或第三期初階段，通過所謂“危機(jī)期”(crisis)，獲得不死性而具有持久或無限增殖的能力。失去接觸抑制。目前五十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前五十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)潛伏期3培養(yǎng)細(xì)胞一代生長(zhǎng)過程指數(shù)生長(zhǎng)期

停止期目前五十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（1）潛伏期目前五十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（2）指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長(zhǎng)，活力最佳，適用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。持續(xù)3~5天。在此階段，若細(xì)胞處于理想的培養(yǎng)條件，將不斷生長(zhǎng)繁殖，細(xì)胞數(shù)量日漸增加。細(xì)胞將接觸而連成一片，漸次鋪滿培養(yǎng)器皿底物，提供細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域逐漸減少甚至消失。因接觸抑制而細(xì)胞運(yùn)動(dòng)停止、密度抑制而細(xì)胞終止分裂。細(xì)胞不再繁殖而進(jìn)入平臺(tái)期。目前五十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（3）平臺(tái)期又稱生長(zhǎng)停滯期。此期細(xì)胞生長(zhǎng)的底物面積已被生長(zhǎng)的細(xì)胞所占滿，細(xì)胞量和密度達(dá)到飽和，細(xì)胞雖尚有活力但已不再分裂增殖，細(xì)胞數(shù)量持平。細(xì)胞雖已停止生長(zhǎng)，但仍存在代謝活動(dòng)并可繼續(xù)存活一定的時(shí)間。若及時(shí)分離培養(yǎng)、進(jìn)行傳代，將細(xì)胞分開接種至新的培養(yǎng)器皿并補(bǔ)充以新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞將于培養(yǎng)器皿中成為下一代的細(xì)胞而再次繁殖。否則細(xì)胞因中毒而發(fā)生死亡。目前五十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前六十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)第二節(jié)動(dòng)物組織培養(yǎng)技術(shù)一、動(dòng)物組織（細(xì)胞）培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)條件1、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)2、常用設(shè)施及設(shè)備3、培養(yǎng)器具4、金屬器材5、輔助器材目前六十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)準(zhǔn)備間

緩沖間

培養(yǎng)室

目前六十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥、無煙塵。實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)實(shí)施原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動(dòng)的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。目前六十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（1）準(zhǔn)備間主要作用

消毒和培養(yǎng)物質(zhì)的準(zhǔn)備以及供應(yīng)物品的保藏等。準(zhǔn)備間內(nèi)應(yīng)有的設(shè)備

水槽和盛物臺(tái)、酸缸、水盆和桶、電爐和鍋、物品準(zhǔn)備臺(tái)和水純化裝置、高壓蒸汽消毒器、電熱干燥消毒箱、儲(chǔ)柜或儲(chǔ)架。目前六十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（2）緩沖室主要作用

減少外界污染源帶入培養(yǎng)室應(yīng)有消毒水、無菌衣和紫外燈或臭氧機(jī)目前六十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（3）培養(yǎng)室（無菌室、操作室）要求

①和緩沖間相連，緩沖間內(nèi)備消毒服裝和鞋，口罩等，入內(nèi)換上

②設(shè)置1—2臺(tái)超凈工作臺(tái)

③室內(nèi)空氣不流通，有適當(dāng)?shù)墓饩€，清潔，干燥

④側(cè)部可設(shè)傳遞窗，用于物品傳遞

⑤照明用熒光燈為好，消毒用紫外線燈

⑥在室內(nèi)工作時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕微設(shè)備

超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱、真空泵或氣泵、冰箱、雜物柜、小型低速離心機(jī)目前六十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、常用設(shè)施及設(shè)備

超凈工作臺(tái)CO2培養(yǎng)箱純化水裝置天平和真空泵目前六十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)超凈工作臺(tái)目前六十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)超凈工作臺(tái)的原理：鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效空氣微粒濾層凈化后，通過工作臺(tái)面，形成無菌環(huán)境。目前六十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)CO2培養(yǎng)箱目前七十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)純化水裝置目前七十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)天平和真空泵目前七十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)3、培養(yǎng)器皿目前七十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)4、金屬器材目前七十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)5、輔助器材加樣器支架離心管冷凍管目前七十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)二、培養(yǎng)前準(zhǔn)備防止污染、無菌操作是動(dòng)物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵！目前七十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（一）培養(yǎng)用品清洗目前七十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1、玻璃器皿的清洗玻璃器皿清洗后不僅要求透明、無污跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。某些化學(xué)物質(zhì)僅殘留百萬分之一毫克，就會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。因此清洗質(zhì)量的好壞直接影響到細(xì)胞培養(yǎng)成功與否，必須嚴(yán)格按照清洗的程序進(jìn)行，以保證達(dá)到清洗的目的。一般玻璃器皿清洗的程序包括：浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個(gè)步驟。

目前七十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（1）浸泡

初次使用和培養(yǎng)用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附著物軟化或溶解。新的玻璃器皿使用前應(yīng)先用自來水簡(jiǎn)單刷洗，然后用5%稀鹽酸溶液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。用過的玻璃器皿往往粘有大量蛋白質(zhì)，干燥后不易刷洗掉，故用后立即浸入清水中刷洗。目前七十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（2）刷洗將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑（不用含沙粒的洗衣粉）水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗，注意不留死角，洗后晾干備浸酸。（3）浸酸刷洗不掉的微量雜質(zhì)經(jīng)過濃硫酸和重鉻酸鉀清潔液的強(qiáng)氧化作用后，可被除掉，而且對(duì)玻璃器皿無腐蝕作用，去污能力很強(qiáng)，是清洗過程中關(guān)鍵的一環(huán)。清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成。浸泡時(shí)，器皿要充滿清潔液，勿留氣泡。浸泡時(shí)間不應(yīng)少于6小時(shí)，一般應(yīng)浸泡過夜。目前八十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（4）沖洗

刷洗和浸酸后都必須用水充分沖洗，使之不留任何殘跡。沖洗宜用洗滌裝置，亦可用手工操作，每瓶都得用水灌滿，倒掉，重復(fù)十五次以上，最后再用蒸餾水漂洗2～3次，晾干備用。目前八十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、橡膠制品的清洗新購(gòu)置的橡膠制品帶有大量滑石粉應(yīng)先用自來水沖洗干凈后，再作常規(guī)清洗處理。常規(guī)處理方法是：每次使用后的橡膠制品都要置入水中浸泡，以便集中處理和避免附著物干涸，然后用2%NaOH液煮沸10～20分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)。自來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水各沖洗2～3次，晾干備用。用過的膠塞的清洗方法基本同清洗玻璃器皿，但膠塞刷洗的重點(diǎn)部位是膠塞使用面，逐個(gè)刷洗。目前八十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)3、塑料制品的清洗塑料制品的特點(diǎn)是：質(zhì)地軟、不耐熱。目前常用的塑料制品是經(jīng)過消毒滅菌密封包裝的商品，用時(shí)打開包裝即可，是一次性使用物品。必要時(shí)，用后經(jīng)過清洗和無菌處理后，也可反復(fù)使用2～3次，但不宜過多。清洗程序?yàn)槭褂煤髴?yīng)即刻浸入水中嚴(yán)防附著物干涸，不宜用毛刷刷洗，以防劃痕出現(xiàn)，如殘留有附著物可用脫脂棉輕輕擦拭，用流水沖洗干凈，晾干，再用2%NaOH液浸泡過夜，用自來水充分沖洗，然后用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，隨后用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水漂洗5～6次，晾干后備用。目前八十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)4、金屬器具的清洗組織細(xì)胞培養(yǎng)所用金屬器具主要是一些手術(shù)刀、剪、鑷子、針等，這些器具使用后應(yīng)立即用酒精擦洗干凈，晾干后備用。目前八十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（二）培養(yǎng)用品包裝包裝的目的是防止器皿器具消毒滅菌后再次遭受污染，所以這些培養(yǎng)用品在消毒處理前要經(jīng)嚴(yán)格的包裝。清洗后的器皿可先放入鼓風(fēng)干燥箱中烘干（塑料和橡膠制品不能放入干燥箱），或置于通風(fēng)無塵處自然晾干，然后包裝起來，再做消毒處理。包裝后的器皿應(yīng)便于消毒和儲(chǔ)存。包裝材料常用牛皮紙、棉布和棉線等，包裝后的培養(yǎng)用品裝入鋁飯盒或不銹鋼飯盒及金屬制的消毒筒內(nèi)。目前八十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（三）器皿器具及環(huán)境的消毒對(duì)組織細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)最危險(xiǎn)的是發(fā)生包括細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染，它們都能直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。組織細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)采取嚴(yán)格的消毒措施，以防止發(fā)生污染。消毒滅菌方法因物品材質(zhì)及環(huán)境的不同而異。消毒方法分為三類：即物理消毒法、化學(xué)消毒法和抗生素抑菌法。目前八十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1、物理消毒法（1）高溫濕熱消毒：即高壓蒸汽消毒，實(shí)驗(yàn)室一般采用高壓滅菌鍋消毒，是最有效的方法之一。對(duì)生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。適合于玻璃器皿、金屬器具、橡膠制品、布質(zhì)類以及耐熱的無機(jī)離子平衡液等的消毒。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體），應(yīng)立即放到60-70℃烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆?，否則，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。目前八十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（2）干熱消毒：實(shí)驗(yàn)室一般采用干燥箱進(jìn)行，由于干熱傳導(dǎo)慢，因此需要升溫到160℃保持90～120分鐘，才能殺死細(xì)菌芽孢，達(dá)到消毒目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶）、金屬器皿。消毒后不要立即打開箱門，以防冷空氣驟然進(jìn)入引起玻璃炸裂，影響消毒效果。燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺(tái)面上的酒精燈火焰對(duì)金屬器皿及玻璃器皿口緣進(jìn)行燒灼消毒。目前八十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（3）過濾消毒：血清、合成培養(yǎng)液、酶液等含有蛋白質(zhì)，具有生物活性，不能采用高溫、高壓消毒的方法進(jìn)行滅菌，因此須采用過濾除菌。實(shí)驗(yàn)室一般主要采用Zeiss濾器。Zeiss濾器為不銹鋼結(jié)構(gòu)，中間可夾一層濾膜，由纖維素制成的微孔濾膜，質(zhì)地均勻，有0.60um、0.45um和0.22um等幾種規(guī)格，常用孔徑0.22um濾膜過濾一般培養(yǎng)用液而除菌。注意：過濾器必須經(jīng)過濕熱消毒，操作過程中，必須將過濾器放在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，以免發(fā)生污染。目前八十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)過濾器目前九十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（4）紫外線消毒：紫外線消毒法很方便，效果好，是實(shí)驗(yàn)室常用的消毒法，適用于消毒空氣、操作臺(tái)表面和一些不能使用其它方法進(jìn)行消毒的培養(yǎng)器具（如少量的塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等）。培養(yǎng)室的紫外線燈應(yīng)距地面2.5米，使得每平方厘米有0.06微瓦能量的照射，才能發(fā)生有效的消毒作用。消毒時(shí)物品要相互分開，避免遮擋紫外線的照射。注意：由于紫外線照射時(shí)會(huì)產(chǎn)生臭氧以及對(duì)細(xì)胞、培養(yǎng)液、包括人體都有一定的損傷作用，因此不要一邊照射一邊操作，以免受傷。照射30分鐘，可達(dá)滅菌效果。目前九十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（5）熏蒸消毒：當(dāng)遇到細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)多次污染，或?qū)嶒?yàn)室兩個(gè)月一次的常規(guī)消毒，均可以用高錳酸鉀5—7.5克，加甲醛（40%）10—15毫升，混合放入一開放容器內(nèi)，立即可見白色甲醛煙霧，消毒房間需封閉24小時(shí)。目前九十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（6）煮沸消毒：它的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，缺點(diǎn)是濕度大，消毒后物品不適于長(zhǎng)時(shí)間保存，這種方法適宜于臨時(shí)需要消毒的耐熱物品，如金屬器具和注射器等在水中煮沸20～30分鐘，趁熱倒去水分即可使用。但金屬器具煮沸后宜馬上使用，以防器具生銹。目前九十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、化學(xué)消毒法化學(xué)消毒劑，包括新潔爾滅、來蘇兒、過氧乙酸和酒精等。主要適用于無法用其它方法消毒的物品，如操作者的皮膚、操作臺(tái)面及無菌室內(nèi)的桌椅、墻壁和空氣等（可于紫外線配合消毒，互相取長(zhǎng)補(bǔ)短）。實(shí)驗(yàn)室最常用的化學(xué)消毒劑是0.2%新潔爾滅和70%的酒精，這些消毒劑對(duì)皮膚和細(xì)胞毒性小，尤其對(duì)那些瓶皿開口部位的消毒，效果很好。過氧乙酸是新近推出的一種消毒劑，消毒能力極強(qiáng)，在0.5%濃度，10分鐘即可將芽孢殺滅，可以用作各種物品的表面消毒，使用時(shí)需用水稀釋后用噴灑和擦拭的方法消毒。目前九十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)3、抗生素消毒法抗生素消毒作用主要是抑制液體內(nèi)的細(xì)菌繁殖，因此適用于細(xì)胞培養(yǎng)用液的消毒，延長(zhǎng)培養(yǎng)用液的有效期?？股胤N類很多，實(shí)驗(yàn)室常用的是青、鏈霉素混合液也稱“雙抗”液，其抑菌效果很好。目前九十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（四）細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞的生長(zhǎng)需要一定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，用于維持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng)、保存細(xì)胞用的物質(zhì)，使細(xì)胞在此環(huán)境中有生長(zhǎng)和繁殖的能力。細(xì)胞培養(yǎng)基組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)離子及激素等。目前九十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1、培養(yǎng)基的組成成分氨基酸：十二種氨基酸必需，谷氨酰銨，谷氨酸等鹽類：鈉離子，鉀離子，鎂離子，鈣離子，氯離子，硫酸根離子，磷酸根離子，碳酸氫根離子等葡萄糖：供能緩沖系統(tǒng)：CO2緩沖系統(tǒng)或HEPES生長(zhǎng)因子：PDGF，EGF，F(xiàn)GF等其它成分：維生素，礦物質(zhì)，有機(jī)補(bǔ)充物，激素等目前九十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、培養(yǎng)基的種類（1）天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基；血清：提供營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，粘附及中和有毒物質(zhì)。

血漿：支持培養(yǎng)組織塊及供給細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，現(xiàn)在不常用。

組織浸出液：可用雞胚胎浸出液，含大分子核蛋白質(zhì)和小分子氨基酸，能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

水解乳蛋白：氨基酸含量高，由乳白蛋白質(zhì)經(jīng)水解得到淡黃色粉末，一般可配制成0.5%溶液。目前九十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)血清血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物。血清種類:主要是牛血清、人血清、馬血清等。牛血清分為小牛、新生牛和胎牛血清。

胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；

新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛；

小牛血清取自出生10－30天的小牛。目前九十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)血清主要作用提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、核酸衍生物等。提供激素和各種生長(zhǎng)因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素、類固醇激素等。生長(zhǎng)因子如bFGF、EGF等。提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等。提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用：有一些細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們?cè)诖x解毒中起重要作用，如硒等。目前一百頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)血清含一些對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如補(bǔ)體、抗體素等都會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至造成細(xì)胞死亡。動(dòng)物個(gè)體不同，血清產(chǎn)地、批號(hào)不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。取材中可能帶入支原體、病毒，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響。血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難。大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源困難，價(jià)格昂貴。目前一百零一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)血清質(zhì)量的鑒定理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng)小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。微生物檢測(cè)：包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。促生長(zhǎng)效果：這是血清重要的特性之一，應(yīng)當(dāng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來檢測(cè)。有三種方法：克隆形成率、貼瓶率測(cè)定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。目前一百零二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)血清判斷好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠；發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性；血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象；搖晃時(shí)感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。要進(jìn)一步了解血清的質(zhì)量，則應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)某些細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。目前一百零三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)血清的使用和儲(chǔ)存使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃、30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。儲(chǔ)存條件：血清一般儲(chǔ)存于-20℃，同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融。使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5－20％，最常用是10％。采購(gòu)血清時(shí)，最好先從供應(yīng)商處索取樣品進(jìn)行試驗(yàn)，選定一批后就要保留足夠使用6個(gè)月至1年的量。目前一百零四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（2）人工合成培養(yǎng)基人工合成培養(yǎng)基：化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基，便于重復(fù)和標(biāo)準(zhǔn)化管理和控制?；境煞譄o機(jī)鹽CaCl2

MgSO4

NaClNaHCO3

NaH2

PO4

氨基酸

維生素脂溶性維生素(A、D、E、K)水溶性維生素包括葉酸、B12等。碳水化合物主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。酚紅目前一百零五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)三種常用培養(yǎng)基配方目前一百零六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)3、其它常用液（1）平衡鹽溶液（2）消化液（3）pH調(diào)整液（4）抗生素溶液（5）谷氨酰胺補(bǔ)充液目前一百零七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（1）平衡鹽溶液功效：①維持滲透壓②提供緩沖系統(tǒng)③提供水分和無機(jī)鹽目前一百零八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成。維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供營(yíng)養(yǎng)。用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。D-Hank's與Hank's的一個(gè)主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Hank's平衡液僅含有0.35g/LNaHCO3，不能用于5%CO2的環(huán)境，若放入CO2培養(yǎng)箱，溶液將迅速變酸，使用時(shí)應(yīng)注意。配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。平衡鹽溶液目前一百零九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（2）消化液胰酶溶液：胰消化酪蛋白的能力常見有1：125和1：250。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH8左右，充分溶解，過濾除菌，分裝4度保存。附：Ca2+、Mg2+是細(xì)胞膜的重要組成成分，它們有促使細(xì)胞凝聚作用。目前一百一十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)消化液EDTA溶液：EDTA溶液也常用來解離細(xì)胞，它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。目前一百一十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)消化液膠原酶溶液：膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為或200000U/L,作用的最佳pH為6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制時(shí)可用PBS。目前一百一十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（3）pH調(diào)整液NaHCO3溶液：NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準(zhǔn)確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達(dá)到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時(shí)常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達(dá)到所要求的pH環(huán)境。目前一百一十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)pH調(diào)整液HEPES溶液：

是一種弱酸，中文全稱是4-羥乙基哌嗪乙磺酸，對(duì)細(xì)胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。目前一百一十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（4）抗生素溶液

常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml，鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。目前一百一十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（5）谷氨酰胺補(bǔ)充溶液谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時(shí)，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。配制時(shí)應(yīng)加溫30℃，完全溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲(chǔ)存于-20℃。目前一百一十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)注意每一個(gè)細(xì)胞系都要進(jìn)行大量，費(fèi)力，費(fèi)時(shí)的工作后，才能找到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液配方，對(duì)正常細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，原代培養(yǎng)，建株培養(yǎng)，懸液培養(yǎng)等所選用的培養(yǎng)液、培養(yǎng)方法可能不同。在開始培養(yǎng)細(xì)胞前，應(yīng)查找有關(guān)文獻(xiàn)。目前一百一十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)組織獲得組織消化

接種

培養(yǎng)

傳代凍存復(fù)蘇等三、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的一般過程目前一百一十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1）制定實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。2）超凈臺(tái)要用75%酒精擦洗，然后紫外線消毒30分鐘，工作臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置。3）個(gè)人進(jìn)入無菌培養(yǎng)室原則上須徹底洗手并按外科手術(shù)要求著裝，開始操作前要用75%酒精或0.2%新潔而滅消毒手和前臂。目前一百一十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)4）實(shí)驗(yàn)中需保持無菌操作要求。實(shí)驗(yàn)前要點(diǎn)燃酒精燈，燒過的器械要注意冷卻，以防細(xì)胞損傷。5）分別使用不同吸管吸取營(yíng)養(yǎng)液、PBS、細(xì)胞懸液及其它各種用液，而不能混用。

6）不要用手觸及已消毒的器皿，如已接觸，要用火焰灼燒或取備用品更換。7）注意操作時(shí)勿大聲講話或咳嗽。目前一百二十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（一）取材1)理論上講，各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)。2）幼體較成體、分化程度低的較分化程度高的、腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。

3）組織取材應(yīng)先切成1cm3的小塊，可置于培養(yǎng)液中4度保存，不易超過24小時(shí)。4）取材時(shí)避免污染及化學(xué)物質(zhì)的損傷。目前一百二十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1、皮膚取材（如大面積燒傷病人）1）皮膚細(xì)胞培養(yǎng)的來源2）方法類似斷層皮片手術(shù)的操作，面積為2－3mm2

3）不用碘酒消毒，但要嚴(yán)格滅菌消毒，必要時(shí)使用抗菌素。目前一百二十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、取鼠胚1）用引頸法殺死動(dòng)物2）浸入75％酒精中5分鐘消毒3）開腹取材目前一百二十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)3、血細(xì)胞取材1）靜脈取血2）指尖或耳垂取血3）用肝素抗凝8~10u/mL4）抽血嚴(yán)格無菌，盡量新鮮使用。

目前一百二十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)4、取雞胚1）選新鮮受精雞蛋，38度孵育9－12天，每天翻動(dòng)雞蛋兩次。2）無菌條件下，將雞蛋置于一個(gè)小燒杯中，令氣室端向上，用碘酒消毒蛋殼，再用酒精消毒。3）用彎剪刀環(huán)行剪除氣室端卵殼，切開卵膜，暴露出雞胚。4）用彎頭鈍鑷子伸入雞胚頭體之間下方，取出雞胚。目前一百二十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)從雞蛋中取出雞胚目前一百二十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（二）組織細(xì)胞的分離消化1、切割分離組織法用剪刀剪至1mm3左右大小的塊。目前一百二十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)原代外植塊培養(yǎng)流程

目前一百二十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、機(jī)械解離分離法某些軟組織如腦、胚胎和一些腫瘤等。

目前一百二十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)3、消化分解法胰蛋白酶法

適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮、肝、腎等。鈣離子、鎂離子、血清等都對(duì)其有抑制作用。目前一百三十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)EDTA法二乙烯四乙酸二鈉，非酶性消化物用于消化分離傳代細(xì)胞，能螯合鈣離子，鎂離子。

EDTA工作液用不含鈣離子和鎂離子的PBS配制成0.02%的濃度，通常和0.25％的胰蛋白酶1：1合用。

目前一百三十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)4、離心法材料為血液、羊水、胸水和腹水等細(xì)胞懸液時(shí)，可以采用離心法分離細(xì)胞。一般多用500－1000rpm，5－10分鐘。目前一百三十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（三）培養(yǎng)細(xì)胞的純化1、自然純化：靠自然的增殖能力，留下優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，去除其他，達(dá)到純化目的，如惡性腫瘤細(xì)胞。2、人工純化：利用人工手段達(dá)到純化目的。酶消化法：上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，成纖維細(xì)胞會(huì)先被消化。機(jī)械劃除法：用機(jī)械外力劃除混雜分區(qū)呈片的不需要細(xì)胞。

反復(fù)貼壁法：根據(jù)不同細(xì)胞貼壁的速度不同?？寺》ǎ号囵B(yǎng)基限定法，流式細(xì)胞分離法等。目前一百三十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)組織取材組織細(xì)胞的分離培養(yǎng)機(jī)械法

消化法

目前一百三十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法（一）懸滴培養(yǎng)法（二）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法（三）旋轉(zhuǎn)管（瓶）培養(yǎng)法（四）灌注小室培養(yǎng)法（五）培養(yǎng)板培養(yǎng)法目前一百三十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（一）懸滴培養(yǎng)法

1、單蓋玻片懸滴培養(yǎng)法①將培養(yǎng)液滴于蓋玻片上并鋪展開②將待培養(yǎng)的組織塊鋪展于培養(yǎng)液中央③將蓋玻片翻轉(zhuǎn)放于凹載玻片上，密封④貼壁24小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞就能從組織塊四周游走適用于組織量少的原代培養(yǎng)目前一百三十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)單玻片的再培養(yǎng)1）用消毒剃須刀刮去蓋玻片四周的石蠟2）用鑷子小心揭開蓋玻片，培養(yǎng)物面朝上，放入培養(yǎng)皿內(nèi)。3）用白內(nèi)障刀切除生長(zhǎng)暈周圍部分，留下方形培養(yǎng)物，并切成小塊。4）將小塊在含有平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿中再漂洗，移入另一含有平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿內(nèi)，進(jìn)行再培養(yǎng)。目前一百三十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、雙蓋玻片懸滴培養(yǎng)法方法和前面基本相同。不同點(diǎn)：取一載體蓋玻片，在其上滴一滴大小適當(dāng)?shù)南菊麴s水。將帶有組織塊的蓋玻片的無組織一面貼到載體蓋玻片上，借助水滴的擴(kuò)展，將兩張蓋玻片貼牢在一起。培養(yǎng)兩天后，將帶有培養(yǎng)物的蓋玻片取下，漂洗后將其貼于一張新的載體蓋玻片上，繼續(xù)培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：1）容易換片。2）培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中，不需移動(dòng)位置，有利于組織分化。目前一百三十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1、培養(yǎng)瓶原代培養(yǎng)器材：培養(yǎng)瓶

材料：組織塊或單層細(xì)胞

（二）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計(jì)了卡氏瓶。Earle設(shè)計(jì)了T-培養(yǎng)瓶。采用的材料透明，對(duì)細(xì)胞無毒。目前一百三十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)基本步驟：無菌取出目的組織用刀無菌切割成1～2mm小塊

以Hanks液漂洗干凈,低速離心，棄上清移入培養(yǎng)瓶，加入適當(dāng)培養(yǎng)基浸潤(rùn)培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)1800，置15～30分鐘，使其貼壁培養(yǎng)瓶翻回，置于37℃培養(yǎng)（1）組織塊培養(yǎng)

目前一百四十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)a：取材修剪沖洗 b：剪切成1mm3左右的小塊c：移入培養(yǎng)瓶 d：分布組織小塊間距5mme：翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加培養(yǎng)液37℃靜止1-2hf：翻正培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng) g：原代細(xì)胞生長(zhǎng)目前一百四十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)無菌取出目的組織用利刀無菌切割成細(xì)塊胰蛋白酶液消化

Hanks液漂洗兩次，低速離心棄上清吸管吹打分散細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶薄層培養(yǎng)（2）組織消化培養(yǎng)

加入30-50倍體積0.25%濃度胰蛋白酶溶液37℃消化30-60min，每5-10min搖動(dòng)一次目前一百四十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)相關(guān)酶類包括：胰蛋白酶、膠原酶、鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等，需根據(jù)酶及組織成分的特點(diǎn)選擇使用目前一百四十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、培養(yǎng)瓶傳代培養(yǎng)吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液加入胰蛋白酶和EDTA混和液

(以能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）吸出消化液，加入培養(yǎng)液終止消化吸管輕輕吹打使細(xì)胞分散成懸液，計(jì)數(shù)

重新接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)（1）貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代

目前一百四十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代目前一百四十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（2）懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代直接傳代法

離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分-800g）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。目前一百四十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（三）旋轉(zhuǎn)管（瓶）培養(yǎng)法器材：旋轉(zhuǎn)管，旋轉(zhuǎn)瓶將培養(yǎng)物接種于一管狀培養(yǎng)器皿（或轉(zhuǎn)瓶）中，再將其固定在一可以旋轉(zhuǎn)的裝置上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的一種方法。目前一百四十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)蓋爾（Gey，1933年）、劉易斯（Lewis，1934年）建立了旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法。特點(diǎn)：培養(yǎng)中組織塊或細(xì)胞交替地與培養(yǎng)液和空氣直接接觸。缺點(diǎn)：不易在顯微鏡下觀察。目前一百四十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（四）灌注小室培養(yǎng)法

基于懸滴培養(yǎng)建立的方法，可用來連續(xù)觀察細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。

研究各種因素影響作用及活細(xì)胞反應(yīng)。1912年由Burrows首創(chuàng)。目前一百四十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)（五）培養(yǎng)板培養(yǎng)法

培養(yǎng)板培養(yǎng)法又稱微量培養(yǎng)法。一般是一次性使用。目前一百五十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)五、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞是一項(xiàng)重要的生產(chǎn)生物制品的技術(shù)，包括疫苗、干擾素、激素、生長(zhǎng)因子和單抗等，具有很高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。常用的方法有：懸浮培養(yǎng)技術(shù)微載體培養(yǎng)技術(shù)多孔微載體培養(yǎng)技術(shù)微囊化培養(yǎng)技術(shù)中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)目前一百五十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1、微載體培養(yǎng)技術(shù)1967年，VanWezel開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，以直徑60-250um微珠作為微載體。原理：將對(duì)細(xì)胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。擴(kuò)大了細(xì)胞的附著面，提高了細(xì)

胞的生長(zhǎng)效率和產(chǎn)量。目前一百五十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)理想的微載體應(yīng)該具備以下幾個(gè)特征：（1）良好的生物相容性、無毒害；（2）良好的黏附性，一般帶正電荷；（3）比表面積大，顆粒均一；（4）良好的傳質(zhì)性能；（5）機(jī)械穩(wěn)定性好；（6）好的熱穩(wěn)定性。目前一百五十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)微載體是由天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）或者各種合成的聚合物組成的。目前商品化的有CytodexⅠ、Ⅱ、Ⅲ，biocarrier，gelibead，和DEAE－cellose等。目前一百五十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、多孔微載體培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：易固定化；比表面大、細(xì)胞在載體內(nèi)生長(zhǎng)，免受機(jī)械損傷；可以提高通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、懸浮細(xì)胞固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)和大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。目前一百五十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)以高溫?zé)Y(jié)法制備多孔陶瓷載體為例（P109）目前一百五十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞具體步驟（P110）選擇合適的微載體類型浸泡水化及消毒接種培養(yǎng)觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)消化分離細(xì)胞傳代培養(yǎng)目前一百五十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百五十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百五十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百六十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百六十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百六十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)微囊法主要適用于單克隆抗體、干擾素等的制備。其原理是將細(xì)胞懸浮于藻酸鈉溶液中，當(dāng)溶液通過一個(gè)可形成小滴的裝置，滴入二氯化鈣溶液，能形成凝聚小球。小球先后用聚-L-賴氨酸和聚乙烯胺溶液洗時(shí)，表面可形成一層半透膜。細(xì)胞可在半透膜內(nèi)生存，代謝過程中的廢物可通過半透膜不斷排出，而分泌的抗體則積累在半透膜形成的囊內(nèi)。小球離心破碎后，可得到大量純度很高的單克隆抗體。3、微囊化培養(yǎng)技術(shù)目前一百六十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)一個(gè)培養(yǎng)筒內(nèi)由數(shù)千根中空纖維所組成，然后封存在特制的圓筒中組成的培養(yǎng)系統(tǒng)。每根纖維管內(nèi)成為“內(nèi)室”，可灌流無血清培養(yǎng)液供細(xì)胞生長(zhǎng)；管與管之間稱為“外室”。接種的細(xì)胞就貼在管壁上，并吸取“內(nèi)室”滲透出來的養(yǎng)分，迅速生長(zhǎng)繁殖。4、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)目前一百六十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百六十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百六十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)RichardKncazek1972年發(fā)明。最初使用醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成海綿狀多孔結(jié)構(gòu)。模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)。目前材料有：硅膠、聚丙烯等。優(yōu)點(diǎn)是：

占地空間少；

細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)109數(shù)量級(jí)；

生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間長(zhǎng)，適用于長(zhǎng)期分泌的細(xì)胞。

目前一百六十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)※

動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器

1、生物反應(yīng)器的特點(diǎn)分析

反應(yīng)器主要結(jié)構(gòu)形式：攪拌式氣升式固定床式技術(shù)要求：能提供均勻溫和的混合狀態(tài)，剪切力小，傳質(zhì)效果好；反應(yīng)器空間利用率高，選用合適載體系統(tǒng)和材料；能保證嚴(yán)格無菌；能控溫、酸堿、溶氧和CO2濃度等；能方便快捷實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液連續(xù)添加，樣品采集和觀察。目前一百六十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用的生物反應(yīng)器柱狀中空纖維反應(yīng)器板框式中空纖維反應(yīng)器中心灌流式反應(yīng)器灌流微載體生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)壁式反應(yīng)器目前一百六十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器目前一百七十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百七十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百七十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百七十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)3、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)產(chǎn)品病毒疫苗：乙肝、脊椎灰質(zhì)炎和狂犬疫苗等非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、白細(xì)胞介質(zhì)、B細(xì)胞生長(zhǎng)因子、巨噬細(xì)胞激活因子、T細(xì)胞替代因子等多態(tài)生長(zhǎng)因子：神經(jīng)、成纖維、表皮、血清生長(zhǎng)因子等酶類：組織血纖維酶原激活劑激素：紅細(xì)胞、促黃體生成素、促濾胞素腫瘤特異性抗原：癌胚抗原單克隆抗體病毒殺蟲劑：桿狀病毒目前一百七十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百七十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)體內(nèi)和體外環(huán)境不同，培養(yǎng)細(xì)胞的生物特性不同。在培養(yǎng)細(xì)胞期間，要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)性檢測(cè)（細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、營(yíng)養(yǎng)液、微生物污染）和生物學(xué)鑒定。第三節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的檢測(cè)和特性鑒定目前一百七十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1、細(xì)胞形態(tài)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，在一般顯微鏡下觀察時(shí)透明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡，才能看清細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。細(xì)胞機(jī)能不良時(shí)，輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特點(diǎn)，如上皮細(xì)胞變成類纖維細(xì)胞等。只有狀態(tài)良好的細(xì)胞才宜利用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在很多情況下，細(xì)胞雖機(jī)能狀態(tài)不良，但仍可生長(zhǎng)，如支原體輕度污染時(shí)即如此。因此生長(zhǎng)與否尚不能作為判定細(xì)胞好壞的唯一標(biāo)準(zhǔn)，必須做全面分析。一、培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查目前一百七十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況很多情況下，開始從組織最先“長(zhǎng)”出的為游走細(xì)胞，它們單獨(dú)活動(dòng)，形態(tài)不規(guī)則，用縮時(shí)逐格顯微電泳法可揭示出它們極活躍的變形、游走和吞噬活動(dòng)。在游走細(xì)胞之后，接著出現(xiàn)的是成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞。說細(xì)胞“生長(zhǎng)”不如說移動(dòng)更為恰當(dāng)，因這時(shí)尚很少見細(xì)胞分裂，僅有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)而已。只有當(dāng)細(xì)胞分裂出現(xiàn)后，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形成較大的生長(zhǎng)暈或連接成片時(shí)，才真正進(jìn)入了生長(zhǎng)狀態(tài)。目前一百七十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)3、培養(yǎng)液在正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。用一般溫箱培養(yǎng)時(shí)，隨細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CO2積累增多，在超越緩沖范圍后，營(yíng)養(yǎng)液酸化變黃，如不及時(shí)調(diào)節(jié)pH，對(duì)細(xì)胞會(huì)發(fā)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞脫落死亡。培養(yǎng)液中加Hepes或用５％CO2溫箱培養(yǎng)可使pH維持穩(wěn)定。用磷酸鹽緩沖系統(tǒng)時(shí)，可因瓶口漏氣，CO2溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶和瓶塞洗刷不潔殘留堿性物，使之變堿發(fā)紅。更換營(yíng)養(yǎng)液時(shí)間，可依營(yíng)養(yǎng)物的消耗而定，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)２－３天換一次，生長(zhǎng)緩慢時(shí)，３－４天亦可。目前一百七十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)4、污染檢測(cè)在長(zhǎng)時(shí)間多量培養(yǎng)工作中，即使用品消毒操作嚴(yán)密，亦難避免偶爾發(fā)生污染。污染途徑---空氣、器材、操作、血清、組織樣品污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及檢測(cè)

體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中加入的抗生素的抗污染能力也是有限的，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽救。目前一百八十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)1）細(xì)菌的污染及檢測(cè)多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞在遭到細(xì)菌的污染后，培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。培養(yǎng)檢測(cè)：可以取少量培養(yǎng)液涂布在無菌瓊脂培養(yǎng)基上，過夜查看。防止：通常在嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作之外，培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素能夠有效的防止細(xì)菌污染。目前一百八十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2）真菌的污染檢測(cè)真菌的污染物通常是培養(yǎng)基表面漂浮的白色及黃色、黑色的小點(diǎn)。在顯微鏡下可見絲狀細(xì)胞的交叉。防止：酒精棉球擦洗清除瓶口污染，必要時(shí)加入抗真菌劑。目前一百八十二頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)3）支原體的污染和防止支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間、能獨(dú)立生活的微生物，無細(xì)胞壁，直徑最小可以達(dá)到0.2μm，在0.22μm的濾膜過濾仍然有1%左右的支原體可以通過。支原體污染后的培養(yǎng)細(xì)胞中沒有明顯可見的特征，所以很難發(fā)現(xiàn)。目前一百八十三頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)相差顯微鏡檢測(cè)：將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間；熒光染色法：用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。電鏡檢查：用掃描電鏡方法簡(jiǎn)便快速，也可以利用透射電鏡。DNA分子雜交檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高，但方法較復(fù)雜。目前一百八十四頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百八十五頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)4）病毒的污染及檢測(cè)濾器對(duì)病毒沒有任何阻擋作用，通常不容易被污染，因?yàn)椴《静荒茉诩?xì)胞外復(fù)制，而且它們通常具有宿主細(xì)胞的感染限制。通常其檢測(cè)方式是抗體檢測(cè)及PCR檢測(cè)。目前一百八十六頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百八十七頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)二、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定1、細(xì)胞形態(tài)觀察內(nèi)容：細(xì)胞形態(tài)、核質(zhì)比例、染色質(zhì)、核仁大小及多少、微絲微管排列狀態(tài)等方法：倒置相差顯微鏡、電鏡目前一百八十八頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、細(xì)胞生長(zhǎng)情況1）細(xì)胞計(jì)數(shù)法血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：人工計(jì)數(shù)細(xì)胞Counter計(jì)數(shù)儀目前一百八十九頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)用酒精沖洗計(jì)數(shù)板后擦凈，將蓋片覆在計(jì)算板上，微微移向一側(cè)，以便滴加細(xì)胞懸液.取一吸管伸入培養(yǎng)瓶，輕輕吹打細(xì)胞懸液，混勻。從蓋片邊緣滴加細(xì)胞懸液，使其充滿計(jì)數(shù)板和蓋片間的空隙中。注意：勿使液體漫過蓋片或出現(xiàn)氣泡。鏡下觀察計(jì)數(shù)：計(jì)算計(jì)數(shù)板四角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線者只計(jì)算左側(cè)和上方的,右側(cè)和下方的不計(jì)算在內(nèi)。目前一百九十頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)2）四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽是一種能接受氫原子的染料，化學(xué)名3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物，并沉積在細(xì)胞中，死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞存活率＝試驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值×100％MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。目前一百九十一頁(yè)\總數(shù)二百零七頁(yè)\編于四點(diǎn)操作步驟（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）。（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔），繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升／孔），