高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座

高效毛細管電泳法

在藥品分析中應(yīng)用

山東藥品食品職業(yè)學院任玉紅年執(zhí)業(yè)藥師繼續(xù)教育2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第1頁

該內(nèi)容共分兩部分進行介紹

第一部分概述

第二部分高效毛細管電泳技術(shù)分離模式及應(yīng)用2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第2頁第一部分概述

高效毛細管電泳法(HPCE

)又稱毛細管電泳法(capillaryelectrophoresis，CE）。是以毛細管為分離通道，以高壓電場為驅(qū)動力，依據(jù)供試品中各組分之間淌度（單位電場強度下遷移速度）和（或）分配行為上差異而實現(xiàn)分離新型液相分離分析技術(shù)。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第3頁

1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；第一次自由溶液電泳；一臺電泳儀;Tiselius建立了移動界面電泳，將電泳發(fā)展成份離技術(shù)。1948年取得諾貝爾化學獎。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第4頁

1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm內(nèi)徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，快速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美嶄新分離分析技術(shù)——高效毛細管電泳。

1988～1989年出現(xiàn)了第一批毛細管電泳商品儀器。當前，在生命科學、藥品分析、以及從小分子、離子到單細胞分析一系列領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第5頁一、高效毛細管電泳法特點高效毛細管電泳法是經(jīng)典電泳技術(shù)和當代微柱分離相結(jié)合產(chǎn)物。

與高效液相色譜法（HPLC）相比，其相同處于于都是高效分離技術(shù)，儀器操作均可自動化，且二者都有各種不一樣分離模式。二者之間差異在于：HPCE用遷移時間取代HPLC中保留時間，HPCE與HPLC相比，分析速度快；柱效高；所需樣品量及流動相用量少；但HPCE僅能實現(xiàn)微量制備，而HPLC可作常量制備；同時，HPCE沒有泵輸液系統(tǒng)，所以成本相對較低，經(jīng)過改變操作模式和緩沖液成份，有很大選擇性，能夠依據(jù)不一樣分子性質(zhì)（諸如大小、電荷數(shù)、疏水性等）對極廣泛對象進行有效分離。而HPLC為到達一樣目標，需要消耗價格昂貴柱子和大量溶劑。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第6頁HPCE和普通電泳相比，因為其采取高電場，所以分離速度快；檢測器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外，其它類型檢測器均已和HPCE實現(xiàn)了連接檢測；普通電泳定量精度差，而HPCE和HPLC相近；HPCE操作自動化程度比普通電泳要高，與傳統(tǒng)電泳相比主要有四個特點，即高效、快速、微量和自動化。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第7頁毛細管電泳技術(shù)兼有高壓電泳及高效液相色譜等優(yōu)點，其突出特點是:

1.儀器簡單、易自動化

電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內(nèi)分離36種無機及有機陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；分離柱效：105～107/m理論塔板數(shù)3.操作模式多，開發(fā)分析方法輕易4.操作方便、消耗少

進樣量極少，水介質(zhì)中進行5.應(yīng)用范圍極廣2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第8頁二、毛細管電泳基本裝置與操作毛細管電泳基本裝置由高壓電源、毛細管、檢測器、電解質(zhì)貯液槽、進樣器、控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。

1－溫度控制系統(tǒng)；2－高壓電源；3－高壓電極槽；4－毛細管；5－檢測器；6－低壓電極槽；7－鉑絲電極；8－統(tǒng)計/數(shù)據(jù)處理檢測器2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第9頁幾個主要部分特點:進樣：最慣用進樣方式為流體力學方式和電動方式兩種。分離：分離部件主要包含毛細管、毛細管恒溫系統(tǒng)和電源。毛細管材料應(yīng)含有化學和電學惰性、紫外可見光透光性、柔韌性、強度高和廉價等特征。熔融石英是毛細管首選材料，最慣用是內(nèi)徑為25～75μm毛細管。檢測：紫外可見光檢測是最慣用檢測方式，不過受到儀器、單波長等原因限制，當前應(yīng)用最廣泛是二極管陣列（PDA）檢測器。液體處理：該系統(tǒng)包含自動進樣裝置、緩沖液更換系統(tǒng)和緩沖液水平系統(tǒng)等。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第10頁完成經(jīng)典HPCE試驗，普通包含以下操作步驟：移開進樣端電解質(zhì)貯液槽，換上樣品管使用低壓或電遷移方式進樣換電解質(zhì)貯液槽加上分離電壓樣品分離，用檢測器進行檢測2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第11頁

電泳

是指在電場作用下，溶液中帶電粒子作定向移動現(xiàn)象。單位電場下電泳速度稱為淌度或電遷移率。離子所帶電荷越多，解離度越大，體積越小，溶液粘度越小，有效淌度就越大，其電泳速度就越快。這也是電泳分離及其條件選擇根本依據(jù)之一。

物質(zhì)離子在電場中差速遷移是電泳分離基礎(chǔ)。三、毛細管電泳法基本理論2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第12頁電滲

高效毛細管電泳操作中一個基本組成部分是電滲流（electroosmosis，EOF）。電滲流是毛細管內(nèi)壁表面電荷所引發(fā)管內(nèi)液體整體流動，起源于外加電場對管壁溶液雙電層作用。

CE所用石英毛細管柱，在pH>3情況下，其內(nèi)表面帶負電，和溶液接觸時形成雙電層。在高電壓作用下，雙電層中水合陽離子引發(fā)流體整體向負極方向遷移現(xiàn)象叫電滲。電滲流是毛細管中溶劑因軸向直流電場作用而發(fā)生定向流動。

2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第13頁電滲流方向

電滲流方向取決于毛細管內(nèi)表面電荷性質(zhì)：內(nèi)表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極；

粒子在毛細管內(nèi)電解質(zhì)中遷移速度等于電泳和電滲流（EOF）兩種速度矢量和，正離子運動方向和電滲流一致，故最先流出；中性粒子電泳流速度為“零”，故其遷移速度相當于電滲流速度；負離子運動方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度普通都大于電泳流速度，故它將在中性粒子之后流出，從而因各種粒子遷移速度不一樣而實現(xiàn)分離。

2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第14頁多數(shù)情況下，電滲流速度是電泳速度5-7倍。所以，在毛細管電泳中利用電滲流可將正、負離子和中性分子一起朝一個方向產(chǎn)生差速遷移，在一次CE操作中同時完成正、負離子分離測定。因為電滲流大小和方向能夠影響CE分離效率、選擇性和分離度，所以成為優(yōu)化分離條件主要參數(shù)。用來控制電滲流方法主要有改變緩沖溶液成份和濃度；改變緩沖溶液pH值；加入添加劑；毛細管內(nèi)壁改性；外加徑向電場；改變溫度等。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第15頁四、影響高效毛細管電泳分離原因1.緩沖溶液

CE中慣用緩沖試劑有：磷酸鹽、硼砂或硼酸、醋酸鹽等。緩沖液濃度升高，離子強度增加，電滲流減小，分析效率提升；同時，增強樣品富集現(xiàn)象，從而提升分析靈敏度。

2．pH值

pH能影響樣品解離能力，樣品在極性強介質(zhì)中離解度增大，電泳速度也隨之增大，從而影響分離選擇性和分離靈敏度。

2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第16頁3.分離電壓

相對較高分離電壓會提升分離度和縮短分析時間，但電壓過高又會使譜帶變寬而降低分離效率。

4.溫度影響

毛細管內(nèi)溫度升高，使溶液黏度下降，電滲流增大。5.添加劑影響6.進樣2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第17頁

第二部分高效毛細管法分離模式及應(yīng)用2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第18頁一、高效毛細管電泳分離模式1、毛細管區(qū)帶電泳(CZE)2、毛細管凝膠電泳(CGE)3、毛細管等速電泳(CITP)4、毛細管等電聚焦(CIEF)5、膠束電動毛細管色譜(MEKC或MECC)6、毛細管電色譜(CEC)2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第19頁1、毛細管區(qū)帶電泳CZE

將待分析溶液引入毛細管進樣一端，施加直流電壓后，各組分按各自電泳流和電滲流矢量和流向毛細管出口端，按陽離子、中性粒子和陰離子及其電荷大小次序經(jīng)過檢測器。中性組分彼此不能分離。正離子在負極最先流出；中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子在負極最終流出，在這種情況下，不但能夠按類分離，同種類離子因為差速遷移被相互分離。

CZE最基本操作模式，應(yīng)用最廣泛，是其它各種操作模式母體。用以分析帶電溶質(zhì)，如各種蛋白質(zhì)、肽、氨基酸分析。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第20頁2、毛細管凝膠電泳

CGE

將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其含有多孔性，類似分子篩作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質(zhì)、DNA等電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式極難分離，采取CGE能取得良好分離，DAN排序主要伎倆。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。

毛細管凝膠電泳分凝膠和無膠篩分兩類。無膠篩分技術(shù)：采取低粘度線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺,稱為毛細管無膠篩分。柱廉價、易制備。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第21頁CGE

是毛細管自由溶液區(qū)帶電泳派生出一個電泳方式，用多孔性凝膠或其它篩分劑作介質(zhì)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，按分子大小分離

2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第22頁

1）將兩種淌度差異很大緩沖液分別作為前導離子(充滿毛細管)和尾隨離子，試樣離子淌度全部位于二者之間，并以同一速度移動。2）負離子分析時，前導電解質(zhì)淌度大于試樣中全部負離子。全部試樣都按前導離子速度等速向陽極前進，逐步形成各自獨立區(qū)帶而分離。陰極進樣，陽極檢測。3、毛細管等速電泳capillaryisotachophoresis，CITP

2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第23頁

3）不一樣離子淌度不一樣，所形成區(qū)帶電場強度不一樣(ν=μE)，淌度大離子區(qū)帶電場強度小，使溶質(zhì)按其電泳淌度不一樣得以分離。4）特點：界面顯著，富集、濃縮作用；慣用于分離離子型物質(zhì)，當前應(yīng)用不多。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第24頁

1)緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度到達臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負電膠束。4、膠束電動毛細管色譜（MECC，MEKC）

在電場力作用下，膠束在柱中移動。被分離物質(zhì)在水和膠束相之間發(fā)生分配并隨電滲流在毛細管內(nèi)遷移，到達分離。

2)電泳流和電滲流方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負電膠束以較慢速度向負極移動；2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第25頁

3)中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強組分與膠束結(jié)合較牢，流出時間長；特點：1）可用來分離中性物質(zhì)，擴展了高效毛細管電泳應(yīng)用范圍；2)色譜與電泳分離模式結(jié)合。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第26頁

1）依據(jù)等電點差異分離生物大分子高分辨率電泳技術(shù)；2）毛細管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成含有不一樣等電點范圍脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（6～8V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高、穩(wěn)定、連續(xù)、線性

pH梯度；3）氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等所帶電荷與溶液pH相關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；5、毛細管等電聚焦

CIEF2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第27頁

4）聚焦：含有不一樣等電點生物試樣在電場力作用下遷移，分別抵達滿足其等電點pH位置時，呈電中性，停頓移動，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離；

5）陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6）加壓將毛細管內(nèi)分離后溶液推出經(jīng)過檢測器檢測；7）電滲流在CIEF中不利，應(yīng)消除或減小。

毛細管等電聚焦電泳已經(jīng)成功用于測定蛋白質(zhì)等電點，分離異構(gòu)體等方面。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第28頁

是將細粒徑固定相填充到毛細管中，或在毛細管內(nèi)壁涂覆固定相，以電滲流驅(qū)動操作緩沖溶液（流動相），使試樣組分在兩相間進行分離電動色譜過程。此模式兼具電泳和液相色譜模式。CEC可分為開管CEC（即管壁涂漬固定相）和填充CEC。6、毛細管電色譜

capillaryelectroosmosticchromatography，CEC2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第29頁二、高效毛細管電泳法在藥品分析中應(yīng)用

高效毛細管技術(shù)在藥品分析中應(yīng)用大致能夠分為兩部分：一是原料藥定量、原料藥中雜質(zhì)測定、藥品制劑分析以及對它們穩(wěn)定性評價等以藥品質(zhì)量控制為目標測定方法。二是對進入人體內(nèi)藥品或代謝物吸收、分布、代謝、排泄等體內(nèi)動態(tài)研究，即臨床藥品分析。

2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第30頁（一）HPCE在藥品質(zhì)量控制方面研究應(yīng)用1．HPCE在中藥分析中應(yīng)用含有分離效率高、分析速度快、分析時間短、樣品前處理簡便、進樣量少、有機溶劑消耗少、操作簡便、分析成本低等優(yōu)點。另外，HPCE在中藥復方制劑復雜成份分析中還含有以下優(yōu)越性：(1)毛細管柱易于全方面清洗，可保持高柱效而使復雜成份很好分離；(2)分離模式多，適合于中藥制劑中各類化學成份分析；(3)不一樣電泳技術(shù)之間及HPCE與NMR、MS等各種技術(shù)聯(lián)用可提升分析精密度，更可拓寬其應(yīng)用范圍。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第31頁當前已經(jīng)有報道，采取HPCE對丸劑、膠囊劑、片劑、合劑、口服液、顆粒劑以及注射劑等中藥制劑或中藥中有效成份進行分析。比如，用膠束電動毛細管色譜（MECC）法測定牡丹皮、白芍、赤芍及其不一樣炮制品牡丹酚、芍藥甙含量；選擇毛細管區(qū)帶電泳（CZE）分離模式，以麻黃素為內(nèi)標，建立了適合莨菪類生物堿一阿托品、東莨菪堿、山莨菪堿、樟柳堿優(yōu)化分離與顛茄酊劑及片劑定量分析方法，可用于莨菪類生物堿中藥制劑質(zhì)量控制等。由此可見，HPCE在中藥制劑質(zhì)量控制及中藥當代化進程中必將發(fā)揮巨大作用。

2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第32頁2．HPCE在天然產(chǎn)物分析中應(yīng)用（1）蛋白質(zhì)、DNA、多肽、氨基酸分析：主要包含肽、蛋白判別、結(jié)構(gòu)分析、微量制備以及蛋白定量測定、純度檢測；測定氨基酸組成、序列和一些物化常數(shù)（如分子量和等電點等）、判別結(jié)構(gòu)和種類不一樣蛋白質(zhì)。在肽和蛋白質(zhì)判別分析中應(yīng)用最多是CZE。對擴散系數(shù)小生物大分子而言，CE還能夠作為搜集非常純單一餾分微量制備伎倆。比如分離多聚核苷酸并對產(chǎn)物進行純度測定等，結(jié)果使人滿意。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第33頁采取MEKC模式，在25分鐘內(nèi)分離了23種丹?；被幔籋PCE可取代傳統(tǒng)氨基酸分析儀實例1：2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第34頁DNA排序?qū)嵗?：2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第35頁（2）糖及其綴合物分析糖分析難點是糖類物質(zhì)普通為電中性，且親水性強，多數(shù)沒有吸光基團，檢測上存在困難。各種新糖衍生化反應(yīng)和檢測技術(shù)應(yīng)用，使CE成為分析單糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等糖類化合物有效伎倆。單糖解離常數(shù)值普通大于11，需選取pH>11強堿性緩沖液，直接進行電泳分離后紫外檢測。這種方法也能用來測定簡單寡糖。多糖普通利用酸解或酶解方法將其轉(zhuǎn)化為寡糖后進行分析。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第36頁在糖檢測方面，UV，EC和LIF（激光誘導熒光）是主要伎倆。比如：葡萄糖、果糖、綿子糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、水蘇糖等單糖能夠利用CZE，膠束電動毛細管色譜（MECC）結(jié)合UV進行檢測；寡糖和多糖主要采取CZE結(jié)合EC方法進行檢測；其它糖類（氨基糖等）則選擇LIF（激光誘導熒光）檢測。2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第37頁3．HPCE在藥品制劑分析中應(yīng)用

CE法含有能排除高含量復雜基體干擾、檢測痕量成份能力，且樣品只需經(jīng)簡單預(yù)處理即可分析其有效成份含量，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于片劑、注射劑、糖漿、滴耳液、乳膏劑及復方制劑等各種劑型中主藥成份定量測定。

如有文件報道用低pH值緩沖液測定糖漿中堿性主藥含量時，因賦形劑呈中性，將停留在進樣端不遷移而在清洗時被沖走，故可將糖漿樣品稀釋后直接進樣，無需前處理。

2023/4/25高效毛細管電泳法在藥物分析中的應(yīng)用專家講座第38頁

比如，采取此方法，經(jīng)過篩選比較，確定緩沖液pH3.0，在HPCE柱上富集測定福莫特羅干糖漿；采取CZE技術(shù)測定5-HT