認知侵襲性真菌感染的實驗室診斷

認知侵襲性真菌感染的實驗室診斷第1頁/共60頁何為侵襲性真菌感染?第2頁/共60頁DFI（deepfungalinfection）真菌侵犯毛發(fā)、表皮、甲床以外的組織（皮下組織、黏膜、肌肉、內(nèi)臟器官、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等）引起的感染。第3頁/共60頁DFI中急、危、重者。真菌在組織器官或血液中生長繁殖，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織器官損傷，常伴多器官功能障礙。

IFI（invasivefungalinfection）第4頁/共60頁2007年歐洲癌癥治療研究組織(EORTC)侵襲性真菌感染協(xié)作組(IFICG)和美國國立變態(tài)反應(yīng)與傳染病研究所霉菌病研究組(NIAID-MSG)將IFI改稱IFD。國內(nèi)未獲響應(yīng)，現(xiàn)僅用于侵襲性念珠菌病(invasivecandidosis,IC)和曲霉病(invasiveaspergillosis,IA)。IFD（invasivefungaldisease）第5頁/共60頁IFI診斷依據(jù)第6頁/共60頁EORTC和NIAID/MSG2007年修訂標準,國內(nèi)各學會診治指南。IFI診斷分級：擬診（possible）臨床診斷（probable）確診（proven）

IFI診斷依據(jù)第7頁/共60頁

IFI分級診斷標準診斷級別高危因素臨床特征微生物學檢查組織病理學證據(jù)擬診++--臨床診斷+++-確診++++第8頁/共60頁（1）血液真菌培養(yǎng)陽性，但曲霉、青霉（馬爾尼菲青霉除外）需排除污染。（2）導(dǎo)管相關(guān)性真菌血癥，導(dǎo)管培養(yǎng)與血培養(yǎng)均陽性，且為同一真菌。（3）胸水真菌培養(yǎng)陽性。（4）肺組織真菌培養(yǎng)陽性。（5）合格痰標本或BALF鏡檢發(fā)現(xiàn)肺孢子菌包囊、滋養(yǎng)體或囊內(nèi)小體。（6）胸水、CSF、血液直接鏡檢發(fā)現(xiàn)新生隱球菌。（7）直接導(dǎo)尿培養(yǎng)念珠菌>105CFU/ml。有確診價值的微生物學檢查第9頁/共60頁常見IFI病原的診斷第10頁/共60頁

以下列念珠菌屬最常見:

白色—（C.albicans）、光滑—（C.glabrata）、熱帶—（C.tropicalis）、近平滑—（C.parapsilosis）、克柔—（C.krusei）、都柏林—（C.dubliniensis）、季也蒙—（C.guilliermondii）。北京大學人民醫(yī)院血液科(2004.4~2005.2間)165株念珠菌，其中：

白念78.8%，其他念珠菌21.2%；張紅金等2006.1~6月ICU患者并發(fā)IFI137例，其中：

白念65株（47.4%）、光滑36株（26.3%）、熱帶28株（20.4%）、平滑5株（3.6%）、克柔2株（1.5%）、青霉1株（0.7%）。常見IFI病原（1）念珠菌屬（Candida）第11頁/共60頁單因素分析:

念珠菌定植、WBC＜0.5×109/L持續(xù)＞10d、使用碳青霉烯類抗生素是惡性血液病患者發(fā)生IC的危險因素；多因素分析:WBC＜0.5×109/L持續(xù)＞10d是IC唯一危險因素。IC發(fā)病的重要前提是念珠菌定植第12頁/共60頁（1）革蘭染色、乳酸酚棉藍染色，鏡檢4~6μm圓或卵圓芽胞，可見出芽，假菌絲。

用含熒光增白劑（CalcofluorWhite，CFW）的10%~20%KOH涂片，紫外線激發(fā)呈藍白或綠色熒光。（2）培養(yǎng)于沙氏培養(yǎng)基生長乳白色酵母樣菌落；玉米粉-Tween80瓊脂生長假菌絲、厚壁孢子；

CHROMagar培基上（35℃）菌落呈色：白念-綠色，熱帶-藍灰，粉紅、邊緣模糊-克柔。其他種為白色至粉紅色。血清（雞蛋清）中37℃2~3h白念產(chǎn)生芽管。種間鑒別用糖發(fā)酵和糖同化試驗。常規(guī)檢查第13頁/共60頁（1）測抗原胞壁1,3-β-D-葡聚糖（G試驗），表面抗原甘露聚糖（LA試驗），熱不穩(wěn)定蛋白（LA試驗），胞漿蛋白烯醇化酶（ELISA和WB），Mr65000蛋白（抑制ELISA）等。（2）測抗體烯醇化酶（P47）抗體（ELISA），白念珠菌芽管抗體（CAGTA）間接免疫熒光法。血清學試驗第14頁/共60頁（1）以ITSI（internaltranscribedspacer1，內(nèi)部可轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1）為靶基因的泛真菌PCR加DNA測序法（可測念珠菌、隱球菌、曲霉、鐮刀菌等多種真菌）。（2）泛曲霉念珠菌檢測法（pan-ACassay）用種特異探計real-timePCR（常見的6種念珠菌、9種曲霉）。（3）以28SrDNA為靶基因的real-timePCR?？蓽y念珠菌、曲霉、隱球菌、毛霉、青霉等。（4）多串連PCR（multiplextandemPCR，MT-PCR）以ITS1、ITS2、EF1-α、β微管蛋白（β-tubulin）為靶基因，可測常見念珠菌、隱球菌、曲霉、鐮刀菌、接合菌等。（5）反向線點雜交（reverselineblothybridization，RLB）和基因芯片（oligonucleotidemicroarray）技術(shù)。尚未獲批準。分子生物學診斷第15頁/共60頁185個種中有20多個可致機會性感染常見為:煙曲霉（A.fumigatus）、黃曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.niger）。棒曲霉（A.clavatus）、灰綠曲霉（A.glaucus）、構(gòu)巢曲霉（A.nidulans）、米曲霉（A.oryzae）、土曲霉（A.terreus）、焦曲霉（A.ustus）、雜色曲霉（A.versicolor）也有報告。常見IFI病原（2）曲霉菌屬（Aspergillus）第16頁/共60頁曲霉菌孢子是鏈狀的，成熟后脫落，2~5μm，易在空氣中懸浮。經(jīng)空氣吸入孢子致病，與定植無關(guān)。第17頁/共60頁

曲霉鑒定主要依靠形態(tài)學特征

血清學試驗：G試驗，GM試驗。分子生物學診斷：同念珠菌屬。

包括:菌落顏色，分生孢子梗形態(tài)、顏色，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)數(shù)目，頂囊形態(tài)等。煙曲霉耐高溫，40℃（38.5~50℃）生長良好。第18頁/共60頁約78個種，致病的約17個種和8個變種，引起IFI的主要為:---新生隱球菌（C.neoformans），

---有新生變種（var.neoformans）（血清型D型），

---格特變種（var.gatii）（B、C型），

---grubii變種（var.grubii）（A型）。在A、B、C、D、AD血清型中，我國已見A、D及AD型，A型最多。常見IFI病原（3）隱球菌屬（Cryptococcus）第19頁/共60頁感染途徑：經(jīng)呼吸道吸入孢子（可從鴿糞、按樹分離），侵犯肺與神經(jīng)系統(tǒng)。鑒定要點：沙氏培養(yǎng)基25℃~37℃均生長。CSF直接或離心沉淀物涂片墨汁染色發(fā)現(xiàn)圓或橢圓雙層厚壁孢子，外有寬莢膜。菌體可見單個出芽。第20頁/共60頁血清學試驗：隱球菌莢菌多糖抗原膠乳凝集試驗(LA),試劑盒法國PaxtorexTMCryptoPlus,紅色膠乳顆粒包被抗糖醛酸木糖甘露聚糖(GXM)單抗。標本：血清、CSF、BALF、尿，血清和CSF用鏈霉蛋白酶56℃、30min預(yù)處理。假陽性：RF>500IU/ml時(9/26)；TB患者血清(2/26)。1:4稀釋轉(zhuǎn)陰。ELISA法：多抗包被，酶標記單抗檢測。不受RF干擾。分子生物學診斷：同念珠菌屬。第21頁/共60頁組織病理中的隱球菌（PAS）第22頁/共60頁墨汁染色中的隱球菌第23頁/共60頁隱球菌性腦膜炎診斷腦脊液檢查墨汁涂片培養(yǎng)動物接種電鏡觀察莢膜抗原乳膠凝集試驗（LAT）分子生物學的方法涂片和培養(yǎng)對于診斷具有決定意義第24頁/共60頁直接墨汁涂片陽性率大約為60%優(yōu)點：快速簡便、可做菌體計數(shù)當腦脊液中的菌體數(shù)較少（低于103/mm3

）常常會有假陰性結(jié)果，需要做進一步的檢查第25頁/共60頁真菌培養(yǎng)對本病的診斷有決定意義，是確診的金標準診斷的敏感性高于直接真菌涂片腦脊液真菌培養(yǎng)的方法，對于培養(yǎng)的結(jié)果具有重要的影響第26頁/共60頁莢膜抗原乳膠凝集實驗（LAT）LAT是以高效價的抗隱球菌莢膜多糖抗體吸附于標準大小的乳膠上，檢測血清或CSF標本中的隱球菌莢膜抗原。特異性接近100%，敏感性約為95%與菌體計數(shù)具有平行性，對于預(yù)后判斷有幫助第27頁/共60頁屬真菌界，子囊菌門，古子囊菌綱，肺孢子菌目，肺孢子菌科，肺孢子菌屬。1909年Chagas首先發(fā)現(xiàn)（克氏錐蟲），至上世紀80年代一直歸為原蟲（真菌培養(yǎng)基不生長；細胞膜無麥角固醇，對麥角醇合成抑制劑類抗真菌藥耐藥，但對抗原蟲藥敏感）。常見IFI病原（4）卡氏肺孢子菌（Pneumocystiscarinii）第28頁/共60頁直接鏡檢：痰（30%）、BALF（75%）、經(jīng)皮穿刺肺活檢（60%）、開胸肺活檢（95%）查找包囊等。染色法：Gomori’s環(huán)六亞甲基四胺銀（GMS），亞甲胺藍、熒光素染色（染包囊壁和囊壁括弧樣結(jié)構(gòu)）。培養(yǎng)：

Uero、CEI、WI-38、MRC-5和Chang肝細胞等。第29頁/共60頁血清學試驗：查抗原：熒光素標記單抗測標本中包囊、滋養(yǎng)體，陽性率97%~99%。查抗體：ELISA、IIF、WB查抗體，陽性率50%~90%，假陽性率高。WB法測抗Mr35000~45000抗體，提示活動感染。分子生物學診斷：同念珠菌屬。第30頁/共60頁無性型在孢子囊內(nèi)形成不能游動的靜孢子，有性型形成接合孢子。毛霉目（Mucorales）、蟲霉目（Entomophthorales）中部分種可致毛霉?。╩ucormycosis）或接合菌?。▃ygomycosis）。常見IFI病原（5）接合菌（Zygomycetes）第31頁/共60頁毛霉屬（Mucor）、根霉屬（Rhizopus）、犁頭霉屬（Absidia）、根毛霉屬（MucorRhizomucor）、被孢霉屬（Mortierella）、共頭霉屬（Sycephalastrum）、小克銀漢霉屬（Cunninghamella）、瓶霉屬（Saksenaea）等致病的種多。吸入孢子、創(chuàng)傷感染、食入污染食物致病。特點是菌絲侵犯血管，引起栓塞、組織壞死、化膿性反應(yīng)和肉芽腫。最常播散至腦，鼻竇炎、眶窩織炎、肺炎。鼻腦毛霉病占30%~50%，病死率80%~90%，次為肺、胃、腸毛霉病。毛霉目中有7個科、12屬、24種致病第32頁/共60頁直接鏡檢標本中見90°角分支的寬大、透明、無分隔或極少分隔菌絲可診斷。確診須從組織切片中找到菌絲。蟲霉目中1科、2屬、3種致?。和芗S霉屬(Basidiobolus)中的固孢蛙糞霉(B.haptasporus)，耳霉屬(Conidiobolus)中的冠狀耳霉(C.coronatus)和異孢耳霉(C.incongruus)。傳入途徑:微小外傷，昆蟲叮咬。第33頁/共60頁直接鏡檢標本中寬大、不規(guī)則，無分隔的薄壁真菌菌絲及其片段。分子生物學診斷：同念珠菌屬。第34頁/共60頁25℃菌絲相、37℃酵母相的致病真菌包括申克孢子絲菌，馬爾尼菲青霉、莢膜組織胞漿菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌等。有的有地域分布特點；對人致病力強，感染無須免疫受損。常見IFI病原（6）雙相型真菌第35頁/共60頁申克氏孢子絲菌

鏡下特征纖細分支分隔菌絲直角分枝的分生孢子梗，頂端梨形或圓形小分生孢子，呈“梅花瓣樣”結(jié)構(gòu)有的小分生孢子沿菌絲兩側(cè)排列，呈“袖套狀”酵母相鏡下可見革蘭陽性卵圓形或梭形孢子第36頁/共60頁第37頁/共60頁第38頁/共60頁自然界土壤、竹筍、甘蔗中（25℃）多以菌絲形式存在，組織中形成酵母樣細胞，兩端鈍圓，有橫隔。竹鼠為帶菌動物。吸入本菌孢子或食入霉變甘蔗發(fā)病。侵犯單核吞噬細胞系統(tǒng)，全身重要臟器均可受累。所致IFI70%見于AIDS患者。馬爾尼菲青霉（Penicilliummarneffei）第39頁/共60頁骨髓、外周血涂片，皮膚、淋巴結(jié)活檢組織涂（切）片，潰瘍分泌物涂片，巨噬細胞內(nèi)外直徑2~3μm，有1~3個橫隔的橢圓（臘腸）形細胞。糖原染色可與黑熱病LD小體和莢膜組織胞漿菌鑒別。培養(yǎng)陽性為診斷金標準。陽性率骨髓100%，皮損90%，血液76%。血清學試驗檢測Mp1基因編碼的本菌特異的胞壁甘露糖蛋白Mp1P抗原或其特異抗體。分子生物學診斷：同念珠菌飛行屬。第40頁/共60頁馬爾尼菲青霉

鑒定依據(jù)雙相菌直接或病理檢查找到臘腸形孢子菌落特征（培養(yǎng)基被染成紅色）和鏡下結(jié)構(gòu)（帚狀枝及孢間連體）在察氏培養(yǎng)基上生長不良（麥芽汁培養(yǎng)基上生長良好）第41頁/共60頁菌絲相酵母相第42頁/共60頁菌絲相(正面)第43頁/共60頁菌絲相(反面)第44頁/共60頁馬爾尼菲青霉第45頁/共60頁臘腸形孢子第46頁/共60頁某些種與大骨節(jié)病、克山病、食管癌有關(guān)，在真菌性角膜炎中占58.7%?？芍滦摹⒛X、肺感染和真菌血癥。引起的IFI逐年增多，發(fā)病率、死亡率僅次于白念珠菌和曲霉所致感染。吸入本菌致肺感染，類似IA。侵犯血管引起血栓致組織壞死。常見IFI病原（7）鐮刀菌屬（Fusarium）第47頁/共60頁特征：典型鐮刀形大分生孢子，大、小不等，有2～5個分隔。但即使多次分離出同一真菌也只能是疑診。確診：培養(yǎng)陽性，病理組織切片發(fā)現(xiàn)本菌。第48頁/共60頁介紹兩個實驗

GM試驗

G試驗

第49頁/共60頁

GM試驗

檢測曲霉半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）抗原。試劑盒：Bio-Rad公司PLATELIATMAspergillusEIA.

原理：一步酶免疫夾心微孔板法……第50頁/共60頁（1）GM連續(xù)2次陽性有臨床診斷價值。（2）GM陰性不能排除IA（GM低于可測限）；高?；颊邞?yīng)每周2次篩查。（3）A值<0.000提示操作、試劑、儀器有誤，應(yīng)復(fù)測。（4）假陰性：見于慢性肉芽腫病，Job’s綜合征及某些用抗真菌藥治療的IA患者。結(jié)果解釋：第51頁/共60頁（5）假陽性：①青霉屬（Penicillium）、交鏈孢屬（Alternaria）、擬青霉屬（Percilomyces）、地絲菌屬（Geotrichum），組織胞漿菌屬（Histoplasma）真菌與EBA-2單抗有交叉反應(yīng)。②某些谷類制品、乳脂點心中含半乳呋喃糖（galactofuranose），牛奶制品（humanizedmilks）含高濃度GM，常在嬰兒造成GM假陽性。③某些批次半合成β內(nèi)酰胺抗生素（piperacillin/tazobactam，amoxicillin與clavulanicacid）中含GM抗原。（6）GM試驗對中性粒細胞減少癥IA患者診斷價值較高，對非中性粒細胞減少的IA診斷價值較差。第52頁/共60頁

G試驗：檢測真菌(念珠菌、曲霉、肺孢子菌等)壁1,3-β-D葡聚糖(glucan).適用于念珠菌、曲霉、肺孢子菌、鐮孢霉等引起的感染。試劑盒:Glucatell(美國CapeCode公司),2003年美國FDA批準,美洲鱟:界值60pg/ml。

Fungitec.G(日本SeikagakuKogyo公司),東方鱟: