反相高效液相色譜法

第1頁(yè)，共12頁(yè)，2023年，2月20日，星期一預(yù)備知識(shí)與氣相色譜法的比較：

流動(dòng)相：由氣相液相與經(jīng)典的液相色譜法的比較：

在經(jīng)典的液相色譜法的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜法的理論，采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了分析速度快，分離效率高和操作自動(dòng)化，這種色譜技術(shù)稱作高效液相色譜法。分類(lèi)分配色譜（partitionchromatography）吸附色譜(adsorption…)離子交換色譜(ionexchange…)尺寸排阻色譜(sizeexclusion…)又稱凝膠色譜氣相色譜只適合分析較易揮發(fā)、且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)化合物，而HPLC則適合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，如揮發(fā)性差、極性強(qiáng)、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。第2頁(yè)，共12頁(yè)，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)高效液相色譜儀的操作2.了解反相液相色譜法分離非極性化合物的基本原理3.掌握用反相液相色譜法分離芳香烴類(lèi)化合物方法原理

選用顆粒很細(xì)的高效固定相，采用高壓泵輸送流動(dòng)相，分離、定性及定量全部分析過(guò)程都通過(guò)儀器來(lái)完成。除了有快速、高效的特點(diǎn)外，它能分離沸點(diǎn)高、分子量大、熱穩(wěn)定性差的試樣。根據(jù)使用的固定相及分離原理不同，一般將高效液相色譜法分為分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜和空間排斥色譜等。在分配色譜中，組分在色譜柱上的保留程度取決于它們?cè)诠潭ㄏ嗪土鲃?dòng)相之間的分配系數(shù)K：第3頁(yè)，共12頁(yè)，2023年，2月20日，星期一本實(shí)驗(yàn)：固定相：ODS-C18，流動(dòng)相：甲醇－水混合溶液分離組分：苯和甲苯的混合溶液流動(dòng)相為非極性而固定相為極性物質(zhì)的色譜稱正相液相色譜法，以流動(dòng)相為極性而固定相為非極性的色譜稱反相液相色譜法。將固定液鍵合到硅膠表面上，即所謂的鍵合固定相。若將正構(gòu)烷烴等非極性物質(zhì)（如n-C18烷）鍵合到硅膠基質(zhì)上，以極性溶劑（如甲醇和水）為流動(dòng)相，則可分離非極性或弱極性的化合物。據(jù)此，采用反相液相色譜法可分離烷基苯類(lèi)化合物。第4頁(yè)，共12頁(yè)，2023年，2月20日，星期一高效液相色譜儀第5頁(yè)，共12頁(yè)，2023年，2月20日，星期一DSC000017HPLC第6頁(yè)，共12頁(yè)，2023年，2月20日，星期一液相色譜流程圖PUMPDetectorWData

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Collection第7頁(yè)，共12頁(yè)，2023年，2月20日，星期一高壓輸液系統(tǒng)要求：流量穩(wěn)定

精度在1～2%之間壓力平穩(wěn)無(wú)脈動(dòng)往復(fù)泵壓力有波動(dòng)，所以柱前設(shè)緩沖裝置（壓力脈動(dòng)阻力器）流速可調(diào)

一般分析儀器：1～2mL/min制備儀器：10～20mL/min儲(chǔ)液瓶高壓泵（核心）過(guò)濾器壓力脈動(dòng)阻力器恒壓泵：輸出壓力恒定，但流速隨系統(tǒng)阻力變化恒流泵：流速恒定，壓力隨阻力變化第8頁(yè)，共12頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1.注射器進(jìn)樣（隔膜進(jìn)樣）帶壓進(jìn)樣停流進(jìn)樣2.高壓定量進(jìn)樣閥（常用）圖六通進(jìn)樣閥

泵柱進(jìn)樣排放泵排放進(jìn)樣柱進(jìn)樣系統(tǒng)第9頁(yè)，共12頁(yè)，2023年，2月20日，星期一色譜柱發(fā)展趨勢(shì)：

填料粒度小柱徑小標(biāo)準(zhǔn)柱型：4.6mm或3.9mmL:15-30cm填料粒度：5-10m裝柱技術(shù)：干法：填料粒度大于20m時(shí)可用。

濕法（勻漿法）：配成懸浮液。高壓泵壓入色譜柱，洗凈備用第10頁(yè)，共12頁(yè)，2023年，2月20日，星期一要求：靈敏度高噪音低線性范圍寬響應(yīng)快死體積小，對(duì)溫度和流速變化不敏感檢測(cè)系統(tǒng)分類(lèi)溶質(zhì)型總體型紫外熒光電化學(xué)示差折光介電常數(shù)激光散射對(duì)組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)對(duì)試樣和洗脫液總的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)通用型本實(shí)驗(yàn)采用紫外光度檢測(cè)器第11頁(yè)，共12頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1、用甲醇配成濃度分別為30ug/mL和10ug/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。2、按下述色譜條件設(shè)定色譜儀：柱溫：室溫；流動(dòng)相流速：A泵：甲醇，0.9mL/minB泵：蒸餾水，0.1mL/min泵最大壓力：15MPa檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm時(shí)間：6min3、根據(jù)儀器操作條件