微生物菌種鑒定與保藏

1微生物菌種鑒定與保藏柳志強

浙江工業(yè)大學生物工程研究所2008·7目前一頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點2內(nèi)容菌種篩選菌種鑒定菌種保藏目前二頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點3微生物代謝產(chǎn)物的平板檢測方法有機酸:

檸檬酸:pH指示劑的顏色變化,或摻入瓊脂平板的碳酸鈣的溶解.胞外酶:1.淀粉酶:由碘指示的可溶性淀粉的液化2.蛋白酶:酪蛋白的溶解3.脂酶:乳化的三丁酸甘油酯的消化,清除或向橄欖油瓊脂中添加0.05-0.25%的OsO4溶液4.果膠酶:果膠凝膠的液化(1.5%的聚果膠酸鈉),多糖沉淀劑5.彈性蛋白酶:彈性蛋白的溶解6.核酸酶(DNA,RNA):未水解的核酸的沉淀,酸過量時可見混濁.或者氮蒽橙熒光和紫外熒光7.磷酸脂酶C:卵磷脂平板的混濁圈8.磷酸脂酶A:卵磷脂平板的透明圈9.纖維素酶:纖維素平板的透明圈10.酯酶:氯化鈣和Tween20釋放出的月桂酸反應生成月桂酸鈣沉淀.或者7-羥-4甲基香豆素熒光反應.DNA酶:亞甲胺藍的DNA熒光變化過氧化酶:噴灑對-茴香堿-過氧化氫酶抑制劑:(用含酶的瓊脂平板上的抑制圈篩選)1.胰蛋白酶抑制劑:2.蛋白酶抑制劑

其他的代謝物:1.脂類.酵母的脂類營養(yǎng)缺陷型的生長譜來撿出2.NAD:以豬流感嗜血菌（haemophilusinflluenzae）的生長譜來撿出3.雌激素:噴灑對硝基苯重氮鹽（1%在50%乙酸中）形成紅色撿出4.chlorostatin:Euglenagracilis褪綠圈

目前三頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點4目前四頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點5目前五頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點6目前六頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點7影印法目前七頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點8顯微鏡第一代第二代第三代目前八頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點9細菌的形態(tài)和結構觀察在顯微鏡下觀察細菌個體的形態(tài)細菌形態(tài)受培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基成分、濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等發(fā)生變化。目前九頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點10

細菌菌落大多表面光滑濕潤，有光澤，一般菌落較小，質(zhì)地顏色均勻，同培養(yǎng)基結合不緊密。菌落特征與組成菌落的細胞結構、生長狀況、排列方式、好氣性和運動性直接相關。目前十頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點11

細菌個體微小，較透明，必須染色方可呈現(xiàn)。根據(jù)細菌個體形態(tài)觀察的不同要求，可將染色分為3種類型：簡單染色、鑒別染色、特殊染色。目前十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點12

放線菌菌落在培養(yǎng)基上著生牢固，與基質(zhì)結合緊密，難以用接種針挑取。放線菌細胞一般呈分枝無隔的絲狀，菌絲體分為在培養(yǎng)基內(nèi)部的基內(nèi)菌絲和伸出培養(yǎng)基表面的氣生菌絲。氣生菌絲上部分化成孢子絲，呈螺旋狀、波浪狀或分枝狀。菌絲呈各種顏色，有的能分泌水溶性色素到培養(yǎng)基內(nèi)。孢子絲長出孢子，孢子形狀各異。由于孢子的存在使菌落表面呈干粉狀。鏈霉菌目前十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點13

霉菌是由交織在一起的菌絲體構成。菌絲呈管狀，有的有橫隔將菌絲分割為多細胞（如青霉、曲霉），有的菌絲沒有橫隔（如毛霉、根霉）。菌絲直徑比一般細菌和放線菌菌絲大幾倍到幾十倍。菌落形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，顏色各異，有絲狀、絨毛狀或蜘蛛網(wǎng)狀的菌絲體。將菌絲體放在水中易變形，將其置于乳酸石炭酸溶液中，保持菌絲體原形。目前十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點14幾類酵母的菌落形態(tài)1.釀酒酵母2.產(chǎn)骯假絲酵母3.出芽短梗霉4.多孢絲抱酵母5.莢復膜孢酵母6.解脂復膜孢酵母7.季也蒙有孢漢遜酵母8.碎囊漢遜酵母9.卡氏酵母10.魯氏酵母11.深紅酵母12.玫紅法佛酵母13.大型羅倫隱球酵母14.美極梅奇酵母15.淺紅酵母目前十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點15目前十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點16一些鑒別培養(yǎng)基目前十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點17

來源于不同微生物的抗生素放線菌產(chǎn)生鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素、利福霉素慶大霉素、麥迪霉素、林可霉素等真菌產(chǎn)生青霉素、頭孢菌素C等細菌產(chǎn)生 多粘菌素、桿菌肽等

目前已篩選出抗生素達9000種以上，每年還新增百余種。投入生產(chǎn)的僅百余種。菌種—發(fā)酵工業(yè)的核心目前十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點18CurrentMethodsofIdentification目前十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點19BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)目前十九頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點20檢測原理BIOLOG以檢測微生物細胞利用不同碳源進行新陳代謝過程中產(chǎn)生的酶與四唑類物質(zhì)（如TTC、TV）發(fā)生顏色反應和濁度差異為基礎，運用獨有的顯型排列技術檢測出每種微生物的特征指紋圖譜，在大量試驗和數(shù)學模型基礎上，建立起指紋圖譜與微生物種類相對應的數(shù)據(jù)庫。檢測時通過智能軟件將待鑒定微生物的圖譜與數(shù)據(jù)庫參比，即可得出鑒定結果。目前二十頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點21鑒定步驟分離純化平板擴大培養(yǎng)制備菌懸液調(diào)整濁度接種培養(yǎng)獲取結果目前二十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點22TheBacterialIdentificationProcess目前二十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點23TheFungiIdentificationProcess目前二十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點24PureCulturesareImportantKrieg,Bergey’sManual,1986目前二十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點25挑取菌落用木制接種棒挑取分離良好的單菌落

目前二十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點26BIOLOG常用消耗品Microlog1Microlog2Microlog3(Microstation)培養(yǎng)基BUG，BUABUG，BUABUG，BUA，BUY鑒定板GN2,GP2,ANGN2,GP2,ANGN2,GP2,AN,YT,FF接種液GN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IF,FF-IF其它通用消耗品疏基乙酸鈉，水楊酸鈉，試管架，吸嘴，加樣槽，一次性移液管，長棉簽，木制接種棒。目前二十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點27微生物鑒定（95種碳源）微生物研究GN2鑒定革蘭氏陰性好氧菌GP2鑒定革蘭氏陽性好氧菌AN鑒定厭氧菌YT鑒定酵母菌FF鑒定絲狀真菌SF－N2用于革蘭氏陰性放線菌和真菌代謝研究SF－P2用于革蘭氏陽性放線菌和真菌代謝研究ECO用于微生物特性和群落分析研究（31）MT2用于微生物代謝研究（不含碳源）ES用于埃希氏大腸桿菌沙門氏菌的研究（95種碳源）鑒定板種類目前二十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點28目前二十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點29目前二十九頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點30ElectronmicrographofstrainZJB-05174cells目前三十頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點31分子遺傳學鑒定

目前三十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點32GenomicDNAextraction目前三十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點33Primersdesign16S/18SrDNAsequenceamplification目前三十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點34DenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)目前三十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點35DNAsequencingmachinesuse

fluorescentdideoxynucleotides目前三十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點36目前三十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點37目前三十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點38目前三十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點39目前三十九頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點40目前四十頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點41目前四十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點42目前四十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點43微生物菌種保藏及其專利申請

按照1977年4月28日各國于布達佩斯簽訂于1980年9月26日修正的《國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約》的解釋，“微生物菌種保藏”的概念是：“向接收與受理微生物的國際保存單位送交微生物或由國際保存單位貯存此種微生物，或兼有上述送交與貯存兩種行為”。如果發(fā)明涉及新的微生物、微生物學方法或者其產(chǎn)品，而且使用的微生物是公眾不能得到的，在申請專利前或最遲在申請日，必須按各國的專利法的有關規(guī)定對微生物進行保藏，申請專利時還需提供相應的申請文件。目前四十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點44國際承認用于專利程序的

微生物保藏布達佩斯條約

1.締約國允許或要求保存用于專利程序的微生物的,應承認為此種目的而在任一國際保存單位所做的微生物保存。這種承認應包括承認由該國際保藏單位說明的保存事實和交存日期，以及承認作為樣品提供的是所保藏的微生物樣品。2.任一締約國均可索取由國際保藏單位發(fā)出的(1)

項所述保藏的藏單副本。

目前四十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點45我國專利法還應辦理下列手續(xù)1.在申請日前或者最遲在申請日，將該微生物菌種提交專利局指定的微生物菌種保藏單位保藏，并在申請時或者最遲自申請日起三個月內(nèi)提交保藏單位出具的保藏證明和存活證明；期滿未提交證明的，該菌種被視為未提交保藏；2.在申請文件中，提供有關微生物特征的資料；3.涉及微生物菌種保藏的專利申請應當在請求書各說明書中寫明該微生物的分類命名（注明拉丁文名稱）、保藏該微生物菌種的單位名稱、地址、保藏日期和保藏編號；申請時未寫明的，應當自申請日起三個月內(nèi)補正；期滿未補正的，該菌種被視為未提交保藏。

目前四十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點46目前四十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點47對基因的占有方式是“基因專利”

基因專利保證了專利擁有者對基因應用領域的高度壟斷，其潛在經(jīng)濟價值和高額回報使得各國的研究機構和大小公司紛紛投入巨額資金。難以想象，如果沒有專利的保護，制藥公司還會不會對基因開發(fā)下這么大的賭注，還會不會有基因相關產(chǎn)品走向市場。正是因為基因專利所賦予的高度壟斷，生物技術領域每一項重要產(chǎn)品的問世幾乎都會引來激烈的專利之爭。

目前四十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點48基因專利的商業(yè)價值

基因專利是研制開發(fā)相關產(chǎn)品的基礎，基因專利的權利人不僅可以通過專利合作或轉讓獲得收益，而且還可以從基于該基因專利的基因產(chǎn)物以及其他衍生產(chǎn)品后期銷售收入中按一定比例提成。一個具有重要功能的疾病或產(chǎn)物相關基因的專利，轉讓價值一般以千萬美元計，而以此開發(fā)的基因藥物年銷售額可高達幾億至幾十億美元。

目前四十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點49基因藥靶的價值1998年9月，Millennium公司與Bayer公司簽訂了五年的基因藥物合作協(xié)議，Bayer公司將向Millennium支付總計4.65億美元(包括14%的股權投資)費用，委托Millennium公司開發(fā)225種基因藥靶，平均每個基因藥靶的價值為207萬美元。促紅細胞生成素EPO：美國Amgen公司依賴EPO基因專利的開發(fā)應用，從一個瀕臨破產(chǎn)的企業(yè)成為美國生物工程醫(yī)藥領域的領頭羊，其EPO1998年的銷售收入達到13.6億美元，而EPO的全球市場現(xiàn)已達到34億美元的銷售額。

目前四十九頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點50基因專利的法律效力

基因專利受法律的保護，專利侵權將要受到法律的制裁。而且，專利授予與否的問題也要服從于法律。HIV受體專利基因專利的壟斷性曾引起轟動，2000年2月16日美國主要從事人類基因測序和商業(yè)化開發(fā)的人類基因組科技股份有限公司(HGS)宣布："她向美國專利和商標局(PTO)成功申請了一個在HIV(艾滋病病毒)感染中起關鍵作用的基因的專利，該基因編碼一個稱作CCR5的細胞表面受體蛋白，該蛋白是HIV病毒侵入人體細胞所必需結合的位點。HGS指出：“該專利覆蓋了艾滋病治療的關鍵點”，HGS已授權其制藥業(yè)的合作伙伴開發(fā)艾滋病治療類藥物，HGS本身也試著進行一些對付HIV感染的有關抗體的研究。HGS預計：“以CCR5為藥靶開發(fā)的新藥，包括艾滋病治療類藥物以及抗?jié)兒涂惯^敏類藥物，每年的銷售額能達到400億美元?！毕⒐己?，HGS股價當天創(chuàng)出新高，達到188美元/股，一天內(nèi)漲幅高達21%。

目前五十頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點51HGS僅僅因為對CCR5基因測了序，就獲得了基于CCR5的有關專利權，而1996年那些首先發(fā)現(xiàn)“HIV通過與CCR5受體結合而侵染人體免疫細胞”的科學家以及那些在愛滋病研究領域做出了巨大貢獻的科學家，卻因在專利申請上比HGS晚了一步而無法享用基于CCR5基因的有關專利?？茖W家們認為“專利局把CCR5基因的潛在商業(yè)價值優(yōu)先給予了一個只是做些基因測序等輔助工作的公司，而不授予為識別該受體、研究其功能做了大量科研工作的科學家，實在不太公平?！睂＠值膽B(tài)度是，他們?nèi)匀豢梢允芾砥渌膶＠?。但專利之間的相互交叉和覆蓋勢必會產(chǎn)生碰撞，難免帶來嚴重的法律問題。然而，HGS并不認為她僅僅是通過基因測序而獲得了CCR5的優(yōu)先權，她是以測序結果為切入點，通過基因數(shù)據(jù)庫的計算機分析推測基因的功能，然后再通過生物學試驗進行基因功能的研究和相關藥物的開發(fā)的。不過，HGS承認她在提交CCR5專利申請的時候并不知道CCR5與艾滋病之間的關系。HGS認為發(fā)現(xiàn)CCR5生物學功能的科學家們應該得到認可，HGS將在科研方面與科學家們共享CCR5的有關數(shù)據(jù)和試劑，但在相關藥物開發(fā)方面，HGS是要嚴格執(zhí)行其專利權利的。由此可見，誰擁有了基因專利，誰就擁有了該基因所有用途的獨占性開發(fā)權，實現(xiàn)的將是對整個產(chǎn)業(yè)的壟斷。目前五十一頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點52生物技術專利戰(zhàn)略

當今全球性經(jīng)濟競爭是一種以科技競爭為中心的角逐，而最先進的科技發(fā)明信息有90％被收集在專利文獻中，專利保護對鼓勵工業(yè)領域的創(chuàng)造和促進產(chǎn)品的開發(fā)和銷售起著重要作用。因為創(chuàng)造性受到專利法的保護，所以，企業(yè)就愿意投資研究新技術，開發(fā)新產(chǎn)品。近年來，各國科學家們也深切地體會到，傳統(tǒng)的科學宗旨已讓位于自我利益，擁有專利和對專利的追求將激發(fā)新的發(fā)明創(chuàng)造，從發(fā)明創(chuàng)造中獲得公共的關注和經(jīng)濟資助變成了科學研究的原動力。西方大公司是世界上發(fā)明專利的主要申請者和利用者，其專利戰(zhàn)略就是如何有目的、有效地利用這一制度。

目前五十二頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點53目前五十三頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點54定義菌種保藏—是指在廣泛收集實驗室和生產(chǎn)菌種、菌株的基礎上，將它們妥善保藏，使之達到不死、不衰、不污染以便于研究、交換和使用的目的。

第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的保藏目前五十四頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點55

菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點，人工創(chuàng)造條件，使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平，缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于“休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。一種好的保藏方法，首先應能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變。菌種保藏的原理目前五十五頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點56

菌種保藏的方法很多，一般有下面幾種：A斜面冰箱保藏法斜面保藏是一種短期、過渡的保藏方法，用新鮮斜面接種后，置最適條件下培養(yǎng)到菌體或孢子生長豐滿后，放在4℃冰箱保存。一般保存期為三個月到六個月。目前五十六頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點57B沙土管保藏法

這是國內(nèi)常采用的一種方法。適合于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物。制備方法：首先，將沙與土洗凈烘干過篩后，按沙與土的比例為l－2∶l混合均勻，分裝于小試管中，裝料高度約為1厘米左右，121°C間歇滅菌三次，滅菌試驗合格后烘干備用。一般沙用80目過篩，土用30－100目過篩。其次，將斜面孢子制成孢子懸浮液接入沙土管中或將斜面孢子刮下直接與沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱內(nèi)保存。一般保存期為1年左右。目前五十七頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點58C、石蠟油封存法向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過菌的石蠟油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蠟油作碳源的細菌、霉菌、酵母等微生物的保存。

保存期約一年左右。目前五十八頁\總數(shù)六十四頁\編于十八點59D、真空冷凍干燥保減法

真空冷凍干燥保藏法是目前常用的較理想的一種方法。其基本原理是在較低的溫度下（－15℃），快速將細胞