毒理學(xué) 環(huán)境有害因素致畸作用

第八章環(huán)境有害因素致畸作用生殖發(fā)育是哺乳動物衍繁種族的正常生理過程，其中包括生殖細(xì)胞(即精子和卵細(xì)胞)發(fā)生、卵細(xì)胞受精、著床(imbed，或稱植入implantation)、胚胎形成、胚胎發(fā)育、器官發(fā)生(organogenesis）、分娩和哺乳過程。生殖發(fā)育也可稱為繁殖過程(reproduction)。外源化學(xué)物或其它環(huán)鏡因素與機(jī)體接觸后，可干擾生殖發(fā)育任何環(huán)節(jié)，并造成損害作用。外源化學(xué)物對生殖發(fā)育的影響：①生殖發(fā)育過程較為敏感，②對生殖發(fā)育過程影響的范圍廣泛和深遠(yuǎn)。近年來隨著毒理學(xué)和生命科學(xué)的深入發(fā)展，外源化學(xué)物對生殖發(fā)育損害作用的研究又進(jìn)一步分為兩個方面：①對生殖過程的影響，即生殖毒性(reproductivetoxicity)的探討，②對發(fā)育過程的影響,即發(fā)育毒性(developmentaltoxicity)研究。兩個方面都逐漸發(fā)展成為毒理學(xué)的分支科學(xué)；前者稱為生殖毒理學(xué)(reproductivetoxicology)，后者稱為發(fā)育毒理學(xué)(developmentaltoxicology）。生殖毒理學(xué)主要涉及外源化學(xué)物對生殖細(xì)胞發(fā)生、卵細(xì)胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳過程的損害作用及其評定，評定方法即為生殖毒性試驗。發(fā)育毒理學(xué)主要研究環(huán)境有害因素對胚胎發(fā)育以及出生幼仔發(fā)育的影響及其評定，評定方法稱為發(fā)育毒性試驗。其中主要為致畸試驗。文獻(xiàn)中也有人將生殖毒性以及生殖毒理學(xué)和發(fā)育毒性以及發(fā)育毒理學(xué)統(tǒng)稱為繁殖毒性和繁殖毒理學(xué)。本章將對發(fā)育毒性著重進(jìn)行討論。第一節(jié)基本概念－、發(fā)育毒性某些化合物可具有干擾胚胎的發(fā)育過程，影響正常的發(fā)育作用，即發(fā)育毒性。發(fā)育毒性的具體表現(xiàn)可分為：1、生長遲緩(growthretardation)，即胚胎的發(fā)育過程在有害環(huán)境因素影響下，較正常的發(fā)育過程緩慢。2、致畸作用(teratogenicity)，由于外源化學(xué)物的干擾，胎兒出生時，某種器官表現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。致畸作用所表現(xiàn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，在出生后立即可被發(fā)現(xiàn)。3、功能不全和異常，即胎仔的生化、生理、代謝、免疫、神經(jīng)活動及行為的缺陷或異常。大多在出生后一定時間才被發(fā)現(xiàn)，因為正常情況下，有些功能在出生后一定時間才發(fā)育完全。4、胚胎致死作用(embryolethality)，某些外源化學(xué)物在一定的劑量范圍內(nèi)、可在胚胎發(fā)育期間對胚胎具有損害作用，并使其死亡。具體表現(xiàn)為自然流產(chǎn)或死產(chǎn)，死胎率增加。在一般情況下，引起胚胎死亡的劑量較致畸作用的劑量為高，而造成發(fā)育遲緩的劑量往往低于胚胎毒性作用的劑量，但高于致畸作用的劑量。以上四種發(fā)育毒性的具體表現(xiàn)并非一定在一種外源化學(xué)物作用下同時出現(xiàn)，有時只出現(xiàn)其中的一種或一部分。此外有些外源化學(xué)物通過胎盤與發(fā)育中的胚胎接觸還可引起子代腫瘤發(fā)生率增高。致畸作用在外源化學(xué)物發(fā)育毒性具體表現(xiàn)中，對存活后代機(jī)體影響較為嚴(yán)重，往往是一種不可逆過程，具有重要的毒理學(xué)意義，有些文獻(xiàn)中，將致畸作用稱為發(fā)育毒性，可以理解為發(fā)育毒性的狹義概念。發(fā)育毒性以及致畸作用是有害環(huán)境因素對機(jī)體損害作用的一種表現(xiàn)。二、畸形、畸胎和致畸物器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常稱為畸形（malformation）。胎兒出生時即具有整個身體或某一部分的外形或器官的解剖學(xué)上的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常稱為先天畸形（congenitalmalformation）畸形的胚胎，稱為畸胎（terate）。凡在一定劑量下，能通過母體對胚胎正常發(fā)育過程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化合物稱為致畸物（teratogen）或致畸原。評定外源化學(xué)物是否具有致畸作用的試驗，稱為致畸試驗。三、胚胎毒性作用胚胎毒性作用（embryotoxicity）一般公認(rèn)的概念系指外源化學(xué)物引起胎仔生長發(fā)育遲緩和功能陷缺不全的損害作用。其中不包括致畸和胚胎致死作用。文獻(xiàn)中也有將生長發(fā)育遲緩、功能缺陷不全和胚胎致死統(tǒng)稱為胚胎毒性者；并有將外源化學(xué)物引起的胎仔形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，即致畸作用稱為胚胎毒性者。四、母體毒性作用母體毒性（matermaltoxicity）作用是指有害環(huán)境因素在一定劑量下，對受孕母體產(chǎn)生的損害作用，具體表現(xiàn)包括體重減輕、出現(xiàn)某些臨床癥狀，直至死亡。進(jìn)一步的概念，可分為輕度和嚴(yán)重母體中毒。輕度母體中毒的表現(xiàn)應(yīng)限于母體體重下降、正常增長受到抑制，被抑制的程度不超過接觸受試物對照組動物的10%。肝重可略有增加，但生殖機(jī)能正常。嚴(yán)重者可出現(xiàn)體重增長大幅度抑制、持久性嘔吐、過度安靜或活動過度、呼吸窘迫、生育機(jī)能明顯受損及其它中毒癥狀，甚至死亡。由于有害環(huán)境因素的致畸作用和母體毒性作用部分與受孕母體有關(guān)，而且往往二者同時出現(xiàn)，所以應(yīng)該特別重視母體毒性作用與致畸作用的關(guān)系。母體毒性與致畸作用的關(guān)系有下列幾種情況：1、具有致畸作用,但無母體毒性出現(xiàn),此種受試物致畸作用往往較強(qiáng)，應(yīng)予特別注意。2、出現(xiàn)致畸作用的同時也表現(xiàn)出母體毒性。此種受試物可能既對胚胎有特定的致畸機(jī)理，同時也對母體具有損害作用，但二者并無直接聯(lián)系。3、不具有特定致畸作用機(jī)理，但可破壞母體正常生理穩(wěn)態(tài)，以致對胚胎具有非特異性的影響，并造成畸形。4、僅具有母體毒性，但不具有致畸作用。5、在一定劑量下，既不出現(xiàn)母體毒性，也未見致畸作用。此種情況較為復(fù)雜，在實際工作中應(yīng)特別認(rèn)真對待。在未表現(xiàn)致畸作用情況下，是否具有母體毒性極為重要。實際有兩種可能；一種是受試初確實不具有致畸作用，而且也不具有母體毒性；另一種情況是動物接觸的劑量未達(dá)到致畸作用的最小有作用劑量，即致畸閾劑量，并非真正不具有致畸作用。嚴(yán)格的概念，在一定劑量下，能引起母體毒性作用，但未觀察到致畸作用，才可以認(rèn)為不具致畸作用。母體毒性與致畸作用的劑量關(guān)系之間，并無固定比值；一般情況下，致畸作用劑量較母體毒性作用劑量為低。五、畸形與變異在胚胎出現(xiàn)的器官形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，有些對子代機(jī)體的生命存在威脅，例如露腦、無腦等可以稱為嚴(yán)重畸形(majormalformation）。另外，有些對生命并無危害如唇裂、缺趾等，可稱為輕度畸形(minormalformation）。與畸形可能同時出現(xiàn)的還有變異。機(jī)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)或生理功能，在同一物種的子代與親代或子代的個體之間，有時出現(xiàn)較大差異的現(xiàn)象，即為變異(variation)。一般認(rèn)為,某些變異并不影響正常生理功能，更不危及生命。變異是生命的一種特征，在生物學(xué)上具有適應(yīng)與進(jìn)化的意義，變異并非畸形，但有時與畸形難于嚴(yán)格區(qū)分。一般情況下，變異出現(xiàn)率較低，而且不呈現(xiàn)劑量與效應(yīng)或反應(yīng)關(guān)系。但是在致畸試驗中，如果某種變異出現(xiàn)較多，而且呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)或反應(yīng)關(guān)系，即使不作為畸形，也應(yīng)另行記錄，并在試驗結(jié)果評定時，作具體分析。第二節(jié)致畸作用的機(jī)理有很多因素可以誘發(fā)畸形，例如輻射能和某些病毒感染都具有致畸作用，但主要是化學(xué)因素，即某些外源化學(xué)物。人類對外源化學(xué)物致畸作用的認(rèn)識和研究，雖然已有30年以上歷史。但關(guān)于其確切機(jī)理尚待闡明，未能形成系統(tǒng)化理論。一、先天畸形的發(fā)生方式受精卵中含有構(gòu)件個體的全部信息，發(fā)育涉及儲存在DNA內(nèi)遺傳信息的逐步表達(dá)，由此產(chǎn)生各種細(xì)胞、組織的分化，各具不同的代謝、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。這一過程由許多不同的調(diào)節(jié)機(jī)制控制，同時也受環(huán)境因素以及鄰近組織誘導(dǎo)作用的影響。這一過程都是很嚴(yán)格地進(jìn)行的，若其中一個環(huán)節(jié)受到干擾，均可導(dǎo)致畸形。有學(xué)者把發(fā)生畸形方式歸納如下：1、不發(fā)育(agenesis)由于某些重要的原基組織(primordialtissue)不存在或缺乏鄰近組織或前體組織的正常誘導(dǎo)而使原基組織不發(fā)生，結(jié)果某個器官或軀體部分發(fā)生或完全缺如。2、發(fā)育不全(hypoplasia)這種畸形常在名詞前冠以“小”字，如小頭、小眼等。此外，亦有軟骨發(fā)育不全等。3、發(fā)育受阻某器官或結(jié)構(gòu)發(fā)育至半途時受阻而停止，可分為四類：①不合并(non-fusion）；②不分裂(non-division），如動脈干永存；③抑制遷移(sup-pressedmigration）；④暫時性結(jié)構(gòu)的保存(persistenceoftransitorystructure），如肛門閉鎖、憩室等。4、相鄰原基粘連如馬蹄腎，或原基分裂，如分裂輸尿管。5、生長過度（overgrowth）如多指、巨指或先天性角化過度等。6、錯位（misplacement）如內(nèi)臟錯位等。7、錯誤遷移（incorrectmigration）如卵巢遷移到外生殖器，并耳等。8、不典型分化(atypicaldifferentiation）包括先天性腫瘤的形成、異位和分化。9、返祖（atavism）常見的有多毛、復(fù)乳等。二、畸形的引發(fā)機(jī)制關(guān)于其確切機(jī)理尚待闡明，尚未能系統(tǒng)化，現(xiàn)歸納如下：1、基因突變和染色體畸變，有些外來出合物作用于生殖細(xì)胞或體細(xì)胞，都可誘發(fā)基因突變和染色體畸變，以致DNA的結(jié)構(gòu)和功能受損，造成胚胎正常發(fā)有障礙，出現(xiàn)畸形,并具有遺傳性。特別是在常規(guī)的致畸試驗中，胚胎與受試物接觸，已進(jìn)入器官發(fā)生期。僅只能作用于體細(xì)胞，與生殖細(xì)胞無關(guān)。但對此也有不同的意見。有人觀察到發(fā)生染色體畸變的細(xì)胞，與透過胎盤的外源化學(xué)物接觸后，一般24h內(nèi)已消失。即使存在穩(wěn)定的畸變，如小缺失(smalldeletion)、倒位(inversion)、和相互易位（reciprocaltranslocation）等，經(jīng)過幾個細(xì)胞分裂周期也不再存在，所以認(rèn)為染色體畸變或突變可能并非致畸的直接原因?？赡苁怯捎谕庠椿瘜W(xué)物對胚胎組織中DNA損害引起的DNA合成減少。2、核酸復(fù)制轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞有絲分裂過程受到干擾，也可引起畸變。3、細(xì)胞內(nèi)必需的能量和前體物(precursor)供應(yīng)不足或代謝過程受到干擾。母體中維生素和無機(jī)鹽營養(yǎng)失調(diào)、低血糖、缺氧等都可造成畸形。由于胚胎組織增值速度極快，在短時間內(nèi)需要消耗大量代謝能量，當(dāng)能量代謝環(huán)節(jié)，例如三羧酸循環(huán)受到破壞和外源化學(xué)物對生物合成前體物呈現(xiàn)競爭性抑制，也可造成畸形。4、在細(xì)胞分化增值過程中，一些重要酶類的抑制或破壞，將影響胚胎正常發(fā)育過程，并引起畸形，例如核糖核酸酶、DNA聚合酶、碳酸苷酶等。5、在細(xì)胞膜正常結(jié)構(gòu)以及滲透性等生物物理性質(zhì)改變的情況下，也可出現(xiàn)畸形。近年來,隨著生命科學(xué)的進(jìn)展,對致畸機(jī)理認(rèn)識逐漸深入,雖然尚未能系統(tǒng)全面闡明，但可能更為概括和深入。有人將致畸作用機(jī)理，歸納為下列四個方面：1、致畸物的細(xì)胞毒性作用由于致畸物對細(xì)胞復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯或細(xì)胞分裂等過程的干擾，影響細(xì)胞的增殖，即表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用，引起某些組織細(xì)胞死亡，因此,在出生時形成畸形。如果接觸致畸物的劑量較低,也可引起細(xì)胞死亡，但速度及數(shù)量可被存活細(xì)胞的增殖所補(bǔ)償，因此出生時未能形成畸形。若致畸物劑量較高，在短期內(nèi)造成大量細(xì)胞死亡，胚胎出現(xiàn)無法代償?shù)膰?yán)重?fù)p傷，則表現(xiàn)出胚胎致死作用。只有接觸超過致畸閾劑量一定范圍的胚胎，細(xì)胞增殖速度才降低。不能對受損組織進(jìn)補(bǔ)償，但并不危及生命，所以出生時有畸形出現(xiàn)。在某些情況下，同一劑量外源化學(xué)物的損害作用，在各窩之間或每窩幼仔之間，同時出現(xiàn)胚胎致死和致畸作用?？赡苁怯捎谕庠椿瘜W(xué)物在不同胚胎體內(nèi)生物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝情況不同；不同窩內(nèi)或同一窩內(nèi)，不同胚胎發(fā)育階段存在一定差異結(jié)果。2、細(xì)胞分化過程的某一特定階段、步驟或環(huán)節(jié)受到干擾此種機(jī)理與上述細(xì)胞毒性作用引起壞死機(jī)理不同。例如,除草醚(nitrofen)其立體結(jié)構(gòu)與甲狀腺激素相似,可引起心臟、隔、腎畸形和肺發(fā)育不全，其作用機(jī)理主要是干擾甲狀腺激素功能。除草醚在母體及胚胎體內(nèi)代謝產(chǎn)物為4-羥基-2，5-二氯-4’-氨基二苯基醚（4-hydroxy-2，5-dichloro-4’-aminodiphenylether），此種代謝物具有甲狀腺激素T3的活性,T3不能透過胎盤,但此種代謝物能透過胎盤，以致引起胚胎早熟以及心臟等畸形。3、母體及胎盤穩(wěn)態(tài)的干擾母體必需的某種營養(yǎng)素,例如維生素A和葉酸的缺乏，某些重要營養(yǎng)素的拮抗物的作用(例如EDTA，為某些微量元素的拮抗物）、母體營養(yǎng)失調(diào)(例如蛋白質(zhì)和熱能供給不足)、營養(yǎng)素由母體至胚胎的轉(zhuǎn)運(yùn)受阻、子宮和胎盤血液循環(huán)障礙包括高血壓癥和接觸5—羥色胺、麥角胺、腎上腺素等作用于血管的化學(xué)物都可破壞母體及胎盤穩(wěn)態(tài)，造成畸形，甚至胚胎死亡和生長遲緩。4、非特異性發(fā)育毒性作用也是發(fā)育毒性作用機(jī)理之一此機(jī)理主要與生長遲緩和胚胎死亡有關(guān)，不涉及畸形作用。此種非特異性細(xì)胞毒性作用的特點(diǎn)是對全部胚胎組織細(xì)胞基本生命現(xiàn)象的干擾。一旦細(xì)胞內(nèi)能量代謝的降低超過一定程度．全部組織將受到損害，并引起胚胎全面生長遲緩，甚至胚胎死亡；不存在靶部位或靶組織。也不可能有部分組織受損與畸形幼仔出生。上述四種說法，尚未能對致畸機(jī)理作出系統(tǒng)而有說服力的闡述，而且實際情況可能更復(fù)雜，有些致畸物可能同時存在兩種作用機(jī)理，即致畸作用以及發(fā)育毒性作用，尚需不斷深入探討。近年來細(xì)胞通訊和程序化細(xì)胞死亡的障礙或干擾及遺傳毒性的研究很受重視，正在深入研究中。現(xiàn)將這兩個熱點(diǎn)問題做一簡要介紹：細(xì)胞死亡被認(rèn)為是正常胚胎形態(tài)發(fā)生的一部分，并且是很多致畸物誘導(dǎo)哺乳動物發(fā)育異常的一個重要的致病機(jī)制。如給小鼠孕11天腹腔注射甲基硝基亞硝基胍(MNNG)所誘發(fā)的畸形是四肢畸形，且后肢多于前肢，左肢多于右肢，觀察肢芽細(xì)胞死亡情況可得到同樣的規(guī)律。說明肢體畸形與肢芽細(xì)胞的死亡有關(guān)。根據(jù)細(xì)胞死亡的模式不同，可分為壞死（necrosis）和調(diào)亡（apoptosis）兩種。70年代經(jīng)過電鏡和細(xì)胞計數(shù)的證實，生理性死亡是易受致畸物干擾而引起畸形的過程，致畸物可誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞死亡，造成靶器官的缺失、發(fā)育不良或生長過度。近期研究表明，磷酰胺芥子氣、N-乙酰基-2-乙酰胺基芴等誘發(fā)的化學(xué)致畸作用中，細(xì)胞調(diào)亡至少是細(xì)胞死亡的主要形式。這一觀點(diǎn)認(rèn)為遺傳毒性是化學(xué)物誘發(fā)致畸或其它發(fā)育毒性的重要機(jī)制。很多致畸物有遺傳毒性，化學(xué)物的致畸性與致突變性之間也有良好的相關(guān)性，也已發(fā)現(xiàn)某些致畸物可引起不同階段胚胎細(xì)胞的突變。近年來研究發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)發(fā)育基因和發(fā)育調(diào)控基因的損傷可導(dǎo)致胚胎的死亡和胎兒畸形。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù),將某一基因插入內(nèi)源性基因，或用基因打靶技術(shù)導(dǎo)致某一基因失效等方法誘發(fā)不同基因損傷，可引起不同階段胚胎的死亡。同樣也發(fā)現(xiàn)某些發(fā)育基因或發(fā)育調(diào)控基因因損傷而導(dǎo)致畸形。第三節(jié)致畸作用的特點(diǎn)－、發(fā)育階段致畸效應(yīng)的特異性胚胎所處的發(fā)育階段不同，對于致畸作用呈現(xiàn)不同的敏感性。有性生殖動物的著床前胚泡(blastocyst)對致死作用較為易感，對致畸作用較差。在胚胎發(fā)育后期和新生兒期的發(fā)育毒性表現(xiàn)為，生長遲緩和神經(jīng)、內(nèi)分泌以及免疫系統(tǒng)機(jī)能的改變。胎兒對致死作用的易感性雖較胚胎為低。在致畸作用中，最敏感的階段是器官發(fā)生期，一般稱為危險期或關(guān)鍵期(criticalperiod）。致畸物與胚胎接觸，可能造成器官發(fā)生期的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。同一劑量同種致畸物在敏感期中與胚胎接觸，可因胚胎所處發(fā)育階段不同而出現(xiàn)不同的畸形。例如在受精后第8至12日期間，以20mg/kg體重劑量每日給予小鼠環(huán)磷酰胺,畸形種類可因給予的日期不同而分別為多趾、并趾、缺趾和無趾。各種不同器官對致畸作用的敏感時間存在很大差異。大鼠器官發(fā)生期為受精后9至17天，但眼的敏感期在受孕后9天，心臟和主動脈弓約為9～10天，腦約在第10天，頭與脊椎骨約在第11天，泌尿生殖器官約在15天。明確致畸作用敏感期的意義，在于致畸試驗中必須正確掌握動物接觸受試物的時間-器官發(fā)生期，否則不能得到正確的試驗結(jié)果。二、致畸的劑量與效應(yīng)關(guān)系1、劑量效應(yīng)關(guān)系復(fù)雜的表現(xiàn)及原因（1）機(jī)體在器官形成期間與具有發(fā)育毒性的化合物接觸，可以出現(xiàn)畸形，也可引起胚胎致死。當(dāng)劑量增加時，毒性作用增強(qiáng)，但二者效應(yīng)程度并不一定成比例，往往胚胎致死作用增強(qiáng)更明顯。由于胚胎死亡增加，畸胎數(shù)將因而減少。（2）在同等條件下某種致畸物可以引起畸形，劑量增加時并不出現(xiàn)同一類型的畸形?？赡苡捎谳^高劑量造成較為嚴(yán)重的畸形，嚴(yán)重畸形有時可將輕度畸形掩蓋。例如一種致畸物在低劑量時，可以誘發(fā)多趾；中等劑量時則誘發(fā)肢體長骨縮短，高劑量時可造成缺肢或無肢。（3）許多致畸物除具有致畸作用外，還有可能同時出現(xiàn)胚胎死亡和生長遲緩，使劑量效應(yīng)關(guān)系極為復(fù)雜。2、致畸作用的劑量反應(yīng)關(guān)系的曲線較為陡峭，斜率較大。最大無作用劑量與100%致畸劑量間距離較小，一般相差1倍。往往100％致畸劑量即可引起胚胎死亡，劑量再增加，引起母體死亡。還有人觀察到致畸作用最大無作用劑量與引起100%胚胎死亡的最低劑量相差2～3倍。例如，按劑量5～10mg/kg體重的環(huán)磷酰胺給予受孕小鼠后不表現(xiàn)致畸作用，但劑量增加到40mg/kg體重，引起100%胚胎死亡。3、致畸作用最大無作用劑量問題尚有不同意見。一般認(rèn)為，機(jī)體接觸低于致畸閾劑量的致畸物時，先天畸形、胚胎致死和生長遲緩發(fā)生率的自然本底數(shù)值并不增高，表明這一劑量即為最大無作用劑量。但也有人認(rèn)為，對于低劑量致畸物的作用與畸形自然發(fā)生率的本底值，尚不能明確區(qū)分，所以致畸作用的最大無作用劑量問題并未解決。另外，評定一種致畸物對人體危害時，應(yīng)充分考慮人體可能實際接觸的劑量。三、致畸的物種個體差異任何環(huán)境有害因素的損害效應(yīng)都存在物種及個體差異。但在致畸作用中較突出。例如，殺蟲劑西維因（carbaryl）對豚鼠具有致畸作用，對家免和倉鼠并不致畸。農(nóng)藥敵枯雙對大鼠致畸作用明顯，但未得到人群調(diào)查的證實資料。曾用于治療妊娠反應(yīng)的反應(yīng)停，由于在人類以及其它靈長類動物具有強(qiáng)烈致畸作用后，停止使用，但小鼠和家兔即使接觸較大劑量，其致畸作用極為輕微。同一物種動物的不同品系對一種致畸物敏感性的差別很大，例如，脫氫皮質(zhì)酮和生物染料錐蟲藍(lán)以及反應(yīng)停都有這種現(xiàn)象。物種及種間差異，可能由于同一致畸物在不同物種和同一物種的不同品系動物的代謝過程有一定差異；再有由于致畸物主要是通過母體胎盤作用于胚胎，而不同物種動物胎盤構(gòu)造也不相同。這些差異可能是由于遺傳因素，即基因型差異。致畸作用物種品系差異的存在，在實際工作中具有重要意義。環(huán)境有害因素的致畸作用以及發(fā)育毒性的評定，主要通過動物試驗得出評定結(jié)果后推論到人類。致畸作用物種品系差異，可能存在對動物不具致畸,但對人類有致畸作用，動物致畸試驗結(jié)果推論到人類造成某些困難。所以對致畸作用的全面評定，必須采用兩種動物進(jìn)行試驗，還要進(jìn)行人群調(diào)查。第四節(jié)發(fā)育毒性的評定致畸是發(fā)育毒性中最重要的一種表現(xiàn)。所以發(fā)育毒性的評定，主要是通過致畸試驗。傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗是評定致畸作用的標(biāo)準(zhǔn)方法，近年來隨著毒理學(xué)和生命科學(xué)的進(jìn)展，也有一些新的方法出現(xiàn)，也略作介紹。一、傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗1、動物選擇致畸試驗中動物應(yīng)選擇，食性和對受試物代謝過程與人類接近，體型小、馴服、容易飼養(yǎng)和易繁殖及價廉外，還應(yīng)特別注意妊娠過程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多和胎盤構(gòu)造與人類接近的動物。致畸試驗可選用二種哺乳動物，一般首先考慮大鼠，此外為小鼠或家兔。大鼠受孕率高，易于得到足夠標(biāo)本數(shù)，而且大鼠對大多數(shù)外源化學(xué)物代謝過程、基本與人類近似。但不足之處是大鼠對一般外源化學(xué)物代謝速度很高，對致畸物耐受性強(qiáng)、易感性低，有時出現(xiàn)假陰性結(jié)果。例如,錐蟲藍(lán)可以干擾大鼠卵黃囊胎盤對胚胎的正常營養(yǎng)過程而導(dǎo)致畸胎，出現(xiàn)陽性結(jié)果。而人類胎盤不具有卵黃囊胎盤階段，所以有時此種結(jié)果對人類為假陽性。小鼠自然畸形發(fā)生率較大鼠高。對形成腭裂的致畸物更較為敏感。家兔為草食動物，與人類代謝功能差異較大，妊娠期不夠恒定，自然發(fā)生率也較高。雞胚也可進(jìn)行致畸試驗，可同時得到大量雞胚，胚胎發(fā)育條件也較易控制。但雞胚不是哺乳動物，缺乏受試物與母體的相互作用。2、劑量分組致畸試驗中劑量分組是極為關(guān)鍵與復(fù)雜的問題。在確定劑量時，一方面要求找出最大無作用劑量以及致畸閾劑量；同時還要保持母體生育能力，不致大批流產(chǎn)和過多胚胎死亡和避免母體死亡。一般應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試。預(yù)試的目的是找出引起母體中毒的劑量，一般用孕鼠8～10只，在妊娠5～16天內(nèi)給予受試物。如出現(xiàn)較嚴(yán)重的母體中毒、流產(chǎn)或胚胎大量死亡，將劑量略為降低，直到找出引起母體輕度中毒一般癥狀的劑量。根據(jù)預(yù)試結(jié)果進(jìn)一步確定正式試驗劑量。正式試驗最少應(yīng)設(shè)3個劑量組，另設(shè)對照組。如受試物溶于某種溶劑中給予動物，則另設(shè)溶劑對照組。有時為了更好地驗證試驗結(jié)果，另設(shè)陽性對照組。原則上，最高劑量組該劑量一般不超過LD50的1/5-1/3，應(yīng)引起母體輕度中毒，即進(jìn)食量減少、體重減輕、死亡不超過10%；最低劑量組可為LD50的1／100～l/30，不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀，；中間劑量組可以允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀，其劑量與高劑量和低劑量成等比級數(shù)關(guān)系。最高劑量組能引起母體輕度中毒，仍未觀察到致畸作用，則可確認(rèn)為該因素不具有致畸作用。如已掌握或能估計人體實際接觸量，也可將實際接觸量作為低劑量，并以其10倍左右為最高劑量。凡急性毒性較強(qiáng)的受試物，所采用劑量應(yīng)稍低，反之可較高。致畸試驗的分組可因試驗?zāi)康牟煌兴兓Ｈ缬^察劑量效應(yīng)（反應(yīng)）關(guān)系，則設(shè)計劑量組數(shù)適當(dāng)增加。3、動物交配處理將性成熟雌雄動物按雌雄1:1或2:1的比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機(jī)分入各劑量組和對照組。確定受孕方法是陰栓檢查或陰道滌片精子檢查，出現(xiàn)陰栓或精子之日即為受孕“0”日，也有人作為第l日。接觸受試物的方式與途徑應(yīng)與人體實際接觸情況一致。對于外源化學(xué)物，一般多采用灌胃方式給予。在特殊情況下，也可采用腹腔注射法，效果與經(jīng)口近似。大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天開始接觸受試物，每日一次，持續(xù)到第15天。如欲研究器官易感性，則應(yīng)在上述期間增加動物組數(shù)，將受試物每日分別給予不同組的動物，根據(jù)畸形出現(xiàn)的情況，確定受試物的敏感時間和靶器官。試驗期間每天稱取母鼠體重。根據(jù)體重增長，隨時調(diào)整劑量，觀察受孕動物的妊娠情況和胚胎發(fā)育情況。受孕動物的體重如持續(xù)增長，則表示妊娠過程及胚胎發(fā)育正常。4、胎仔檢查自然分娩前1～2日將受孕動物處死剖腹，取出子宮及活產(chǎn)胎仔，記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家免在第29天。胎仔在臨近出生期間，發(fā)育進(jìn)展極為迅速。相差半日，發(fā)育情況即有顯著差異，骨骼發(fā)育尤為顯著。孕鼠處死后，從子宮頂端依次取出其中活產(chǎn)幼仔、死胎以及吸收胎，并記錄編號。大鼠和家免還應(yīng)取出卵巢，記錄黃體數(shù)用來代表排卵數(shù)。活產(chǎn)胎仔取出后，先檢查性別，逐只稱重，并按窩計算平均體重，然后由下列幾方面進(jìn)行畸形檢查：①外觀畸形肉眼檢查，例如露腦：②肉眼檢查內(nèi)臟及軟組織畸形，如腭裂；③骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損等?；螜z查只限活產(chǎn)胎仔。一般可將活產(chǎn)胎仔進(jìn)行肉眼檢查，然后將其中2/3經(jīng)過固定、透明和茜素紅（alizarinred）染色等步驟，觀察骨骼畸形。另外經(jīng)鮑音氏（Bouin）表8-1胎仔活產(chǎn)、死亡和吸收的特征種類顏色器官外形自然運(yùn)動對機(jī)械刺激的反應(yīng)胎盤活產(chǎn)胎仔肉紅色完整成形有有運(yùn)動反應(yīng)紅色，較大晚期死胎灰紅色完整成形無無運(yùn)動反應(yīng)色灰紅，較小早期死胎烏紫色未完整成形無——暗紫吸收胎暗紫或淺不能辨認(rèn)胚胎————不能辨認(rèn)胚胎色點(diǎn)塊和胎盤和胎盤溶液固定2周以上，再檢查內(nèi)臟及軟組織異常情況。近年來，認(rèn)為關(guān)于胎仔中1/3檢查內(nèi)臟，2/3檢查骨骼，缺乏足夠的理論和依據(jù)。因此多改為將兩個子宮角的胎仔各1/2，隨機(jī)分配于骨骼和內(nèi)臟組畸形檢查。也有人主張將試驗雌鼠保留近1/4，待其自然分娩，并將出生幼仔飼養(yǎng)觀察，至少到斷奶，以便檢查可能存在的先天缺陷和生理功能異常。為保證哺乳機(jī)會，一般主張每窩保留8只幼仔，并盡量雌雄數(shù)量相等。5、結(jié)果評定致畸試驗結(jié)果的評定，主要是計算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)?；タ倲?shù)：每一活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)一種或一種以上畸形均作為一個畸胎；畸形總數(shù)：在同一幼仔每出現(xiàn)一種畸形，作為一個畸形。如出現(xiàn)二種或二個畸形，則作為二個畸形計，并依此類推。常用作致畸結(jié)果的評定指標(biāo)：（1）活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)，見下式：活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)=畸形總數(shù)/活產(chǎn)幼仔總數(shù)（2）畸形出現(xiàn)率，見下式：畸胎出現(xiàn)率=出現(xiàn)畸形的胎仔總數(shù)/活產(chǎn)胎仔總數(shù)×100%（3）母體畸胎出現(xiàn)率，同一母體無論出現(xiàn)多少畸形胎仔或多少種畸形，一律按一個出現(xiàn)畸胎的母體計算，見下式：母體畸胎出現(xiàn)率=出現(xiàn)畸胎的母體數(shù)/妊娠母體數(shù)×100%還可計算各組動物受孕率、雌性動物平均體重和妊娠期增長體重數(shù)。妊娠期增長體重數(shù)相當(dāng)于（處死時體重）一（妊娠第6天體重）－（處死時子宮及胎仔重量）。此外以窩為單位計算每窩平均活產(chǎn)胎仔數(shù)、死胎率、吸收胎率、平均胎仔體重（雌雄分別計算），活產(chǎn)胎仔雄雌性別比例（雄性胎仔數(shù)／雌性胎仔數(shù)）和每窩活產(chǎn)胎仔平均體重。6、致畸物以及發(fā)育毒性作用物危險度評定對于致畸物危險度及致畸作用機(jī)理尚未充分闡明。評定方法方法較多。雖然各有一定的根據(jù)，但都具有一定的經(jīng)驗性質(zhì)，而且缺乏大規(guī)模的實際驗證?，F(xiàn)擇要介紹幾種，供實際工作中參考。（l）歐洲經(jīng)濟(jì)共同體(EEC)和經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)建議的致畸物分級標(biāo)準(zhǔn)，可簡稱EEC和OECD致畸物分級標(biāo)準(zhǔn)。主要根據(jù)動物試驗和人群調(diào)查資料,具體分級標(biāo)準(zhǔn)如表8-2：（2）致畸指數(shù)：母體LD50與胎仔最小致畸作用劑量之比,這一比值愈大，致畸作用愈強(qiáng)，一般認(rèn)為比值10在以下者，不具致畸作用，10～100具致畸作用，100以上致畸作用強(qiáng)烈。

表8-2致畸物的參考分級標(biāo)準(zhǔn)級別分級依據(jù)對人類危險性1已確定人類母體接觸后可引起子代先天性缺陷已證實對人致畸2A對動物肯定致畸，但對人類致畸作用尚未確定對人可能致畸因果關(guān)系2B動物試驗結(jié)果肯定致畸，但無人類致畸資料對人可能致畸3尚無結(jié)論性肯定致畸證據(jù)或資料不足可以認(rèn)為對人無致畸作用，但應(yīng)繼續(xù)研究4動物試驗陰性，人群中調(diào)查結(jié)果未發(fā)現(xiàn)致畸對人無致畸作用

（3）相對致畸指數(shù)（RTI）：成年動物最小致死劑量（LD01）與引起5%活產(chǎn)胎仔出現(xiàn)畸形的劑量（tD50）之比值。（4）母體毒性與發(fā)育毒性比值：即對母體最低損害作用劑量(A)與胎仔最低損害作用劑量(D)之比(A／D)。一般認(rèn)為A／D比值≥3，具有發(fā)育毒性危險性。比值越大，危險性越高，≤3者，相對危險性較低或不具危險性。利用V/D比值評定某一外源化學(xué)物或其它環(huán)境有害因素致畸危險性時，還可將人體實際接觸的劑量考慮在內(nèi)。有人提出、A／D比值中母體最低損害作用劑量的測定，應(yīng)在妊娠動物進(jìn)行，否則不夠精確。二、致畸物體內(nèi)篩檢試驗法體內(nèi)篩檢試驗法主要研究篩檢對象為受孕小鼠或大鼠。實驗最少設(shè)兩個劑量組和一個對照組。高劑量組給予未孕鼠最小有作用劑量，允許產(chǎn)生明顯母體毒性。在妊娠6-15日期間，每日記錄母鼠體重，待其自然分娩。本法是利用孕鼠對外源化學(xué)物是否具有致畸作用,進(jìn)行初步篩檢的體內(nèi)試驗。除可初步觀察大體畸形外。還可觀察胚胎致死、生長遲緩等其它發(fā)育毒性表現(xiàn)，其特點(diǎn)是簡單易行，不進(jìn)行傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗中需要的檢查，時間、費(fèi)用和人力都較節(jié)約，可滿足大量外源化學(xué)物進(jìn)行致畸試驗的需要。此外，還可確定生長發(fā)育遲緩是否為可逆性。三、其它試驗近年來隨著客觀形勢的需要和細(xì)胞組織和器官培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步。建立了全胚胎培養(yǎng)、胚胎的某一器官(例如肺、牙齒、腎等)培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)的體外試驗法。發(fā)育過程本身包括細(xì)胞增殖分化等極為復(fù)雜的各種過程，致畸作用的機(jī)理也尚未充分闡明，所以選擇適當(dāng)觀察指標(biāo)極為重要。幾種重要的體外試驗方法如下：1、全胚胎培養(yǎng)法系將試驗動物的全胚胎在一定的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察在接觸受試物的情況下，是否呈現(xiàn)致畸作用以及發(fā)育毒性。胚胎可來自大鼠、小鼠和家兔。2、器官培養(yǎng)法系將胚胎或胎仔組織、器官或器官的一部分在體外培養(yǎng)，觀察外源化學(xué)物對其發(fā)育過程的影響。3、細(xì)胞培養(yǎng)法傳代細(xì)胞株(cellline)和原代細(xì)胞都曾用于外源化學(xué)物致畸作用評定。主要根據(jù)是致畸物可以干擾細(xì)胞的正常生長過程。但細(xì)胞株經(jīng)長期傳代培養(yǎng)，往往失去細(xì)胞原有特性。根據(jù)目前的經(jīng)驗，肢芽細(xì)胞培養(yǎng)法對外源化學(xué)物致畸作用預(yù)測準(zhǔn)確度可達(dá)到89%，神經(jīng)元培養(yǎng)法為85％。四、生殖毒性和發(fā)育毒性三階段一代試驗法為60年代后期美國食品藥物管理局（FDA）首先提出的一種試驗法。其中包括三個試驗階段，各有一定的試驗?zāi)康?，可以分別單獨(dú)進(jìn)行。一般稱為三階段一代繁殖試驗（threesegmentreproductiontest）：第一階段和第二階段分別與生殖毒性試驗和傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗相似（表8-3）。但其第三階段試驗系觀察外源化學(xué)物對胚胎后期和出生后發(fā)育的影響：表8-3大鼠行為致畸實驗程序檢查或測定項目檢查（測定）日期（日齡）檢查或測定項目檢查（測定）日期（日齡）檢查每窩仔鼠的數(shù)目1視覺發(fā)育16-21和性別斷乳21每窩隨意選8-12只1神經(jīng)組織學(xué)檢查21仔鼠作為觀察對象分窩飼養(yǎng)25實驗動物編號1轉(zhuǎn)輪試驗（運(yùn)動量）曾試驗者未試驗者稱重1、7、14、2130-51—張耳1至全部仔鼠張耳開闊場試驗及情動—40-43出牙（門齒）1至全部仔鼠出牙試驗向前運(yùn)動的發(fā)育情況