分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)基因操作工具酶

第一節(jié)基因操作工具酶目前一頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)酶酶限制性核酸內(nèi)切酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA連接酶末端轉(zhuǎn)移酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

S1核酸酶Klenow酶DNA酶Ⅰ

TaqDNA聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶堿性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶目前二頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)主要內(nèi)容1限制性核酸內(nèi)切酶2DNA連接酶3DNA聚合酶4修

飾

酶5小結(jié)目前三頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)酶主要用途限制性核酸內(nèi)切酶識別DNA特定序列，切割DNA分子DNA連接酶連接兩個(gè)DNA分子或片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作DNA探針；2合成cDNA第二鏈；3填補(bǔ)雙鏈DNA3`凹端；4DNA測序。TaqDNA聚合酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解單鏈DNA或RNADNA酶Ⅰ在雙鏈DNA上產(chǎn)生隨機(jī)切口RNA酶A降解RNA逆轉(zhuǎn)錄酶補(bǔ)平反應(yīng)，合成cDNA或制探針堿性磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARYHome目前四頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)1限制性核酸內(nèi)切酶1.1引言1.2命名1.3分類1.4活性及影響因素Home目前五頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)核酸酶（Nuclease）：通過切割相鄰兩個(gè)核苷酸殘基間磷酸二酯鍵，導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈水解斷裂的蛋白酶。（1）按作用對象分:DNAase&RNAase（2）按斷裂核酸分子不同方式分：

Endonuclease&Exonuclease1.1引言—兩個(gè)概念目前六頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)限制性內(nèi)切核酸酶（restrictionendonuclease):

指一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。限制酶與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)（Restriction-ModificationSystem)。Back目前七頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)1.2命名命名原則：第一個(gè)字母（大寫,斜體）：該酶來源的微生物屬名；第二、三個(gè)字母（小寫、斜體）：微生物種名；若該微生物有不同的變種和品系，再加上該變種和品系的第一個(gè)字母（大寫）若從同一微生物發(fā)現(xiàn)多種限制性內(nèi)切酶，則依照發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。例如：EcoRⅠ從大腸桿菌R株分離的第一種限制酶命名為EcoRⅠ，其中E代表屬名（Escherichia)，co代表種名（coli)，R代表株系（RY13），Ⅰ代表該菌株中首次分離到。Back目前八頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)1.3分類1.3.1Ⅰ型限制性內(nèi)切酶

Ⅱ型限制性內(nèi)切酶1.3.3Ⅲ

型限制性內(nèi)切酶Back目前九頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)1.3.1Ⅰ型限制性內(nèi)切酶功能：限制、修飾特點(diǎn)：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因子；識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致，無固定切割位點(diǎn)；應(yīng)用：不常用。Back目前十頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)1.3.2Ⅲ型限制性內(nèi)切酶功能：限制、修飾特點(diǎn)：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因子；特異切割，切割位點(diǎn)在距識別位點(diǎn)3`端24-26bp處。應(yīng)用：數(shù)量很少，無實(shí)際作用。Back目前十一頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)1.3.3Ⅱ型限制性內(nèi)切酶功能：識別并特異切割DNA分子。

即通常所指DNA限制性核酸內(nèi)切酶；反應(yīng)特點(diǎn)：僅需Mg2+作催化反應(yīng)輔助因子，能識別雙鏈DNA特殊序列，并可特異切割DNA，產(chǎn)生特異片段；應(yīng)用：種類繁多，分子克隆中最為常用目前十二頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)(1)基本特性識別長度為4-8個(gè)核苷酸的特異序列；許多識別序列具回文結(jié)構(gòu)，如HindⅢ的識別序列：5`AAGCTT3`3`TTCGAA5切割產(chǎn)生末端有粘端(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)和平端(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)目前十三頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)EnzymeRecognitionseuqenceEnzymeRecognitionseuqenceBamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAGRecognitionSequencesandCuttingsitesofRestrictionEndonucleases目前十四頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)(2)同功異源酶(isoschizomer)

來源不同但能識別和切割同一位點(diǎn)的酶。又稱同裂酶。如：BamHI

(G↓GATCC)和BstI

(G↓GATCC)注：有一些同功異源酶對于切割位點(diǎn)上的甲基化堿基的敏感度有所不同。目前十五頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)(3)同尾酶（isocaudamer)

識別序列不同，但產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶。如：BamHI:G↓GATCC

BglII:A↓GATCTBack目前十六頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)1.4

活性及影響因素(1)活性大小：酶對DNA水解程度不同。(2)酶的活性單位：

指1μg純的指定DNA在指定緩沖液中，于37℃（最適溫度更準(zhǔn)確）酶解1h完全酶解DNA中所有同一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)所需的酶量。目前十七頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)(3)影響因素①DNA模板的純度②DNA的甲基化程度③酶切反應(yīng)溫度④DNA的分子結(jié)構(gòu)⑤緩沖液Back目前十八頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)2DNA連接酶2.1定義及功能2.2種類及作用機(jī)理2.3使用時(shí)的注意事項(xiàng)Home目前十九頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)2.1定義及功能DNA連接酶（DNAligase）：可使一段DNA3`-OH末端和5`-P末端形成3`,5`-磷酸二酯鍵，把兩DNA片段連在一起封閉雙鏈上形成的切口的酶。目前二十頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)OHP5`3`3`5`5`3`3`5`DNAligaseDNAligase連接缺刻(nick)Back目前二十一頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)兩類:

◆T4DNA連接酶(ATP提供能量）

◆大腸桿菌DNA連接酶（NAD+提供能量）2.2種類及作用機(jī)理目前二十二頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)T4DNAligase的作用機(jī)理Back目前二十三頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)1)不能催化兩單鏈DNA分子連接；2)只能連雙鏈DNA分子的單鏈缺刻(nick)；不能連接雙鏈中一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失所致缺口(gap)。2.3使用時(shí)的注意事項(xiàng)目前二十四頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)DNAligase的活性Back目前二十五頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)3DNA聚合酶（DNApolymerase）3.1DNA聚合酶I3.2Klenow聚合酶3.3TaqDNA聚合酶3.4逆轉(zhuǎn)錄酶3.5T4DNA聚合酶3.6T7DNA聚合酶Home目前二十六頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)3.1DNA聚合酶Ⅰ活性：5`→3`聚合活性，5`→3`外切和3`→5`外切活性。發(fā)揮生物學(xué)活性的條件：（1）DNA模板（可以是單鏈或雙鏈）（2）帶有3`-端游離羥基的引物鏈（3）底物和激活劑注：對雙鏈DNA，當(dāng)有dNTP存在時(shí)，3`→5`降解活性會(huì)被5`→3`方向的聚合活性所抑制。應(yīng)用：缺口平移法制備DNA分子雜交探針目前二十七頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)缺口DNaseIDNA聚合酶IDNA聚合酶IdNTP*缺口缺口平移法制備DNA分子探針Back目前二十八頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)活性：

5`→3`聚合活性，3`→5`外切酶活性，無5`→3`外切酶活性。用途：（1）填補(bǔ)或標(biāo)記DNA的3`隱蔽末端；（2）催化合成cDNA第二鏈；（3）DNA序列測定3.2Klenow聚合酶目前二十九頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)EcoRI酶切末端同位素標(biāo)記的EcoRI酶切末端α-32P-dATPBack目前三十頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)顯著特點(diǎn)：熱穩(wěn)定性。70℃反應(yīng)2h殘留活性90%；93℃反應(yīng)2h殘留活性60%；94℃反應(yīng)2h殘留活性40%。應(yīng)用：（1）對DNA的特定片段進(jìn)行體外擴(kuò)增；（2）DNA序列測定。3.3TaqDNA聚合酶Back目前三十一頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)：又稱RNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶?；钚裕?/p>

5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是帶3`-OH的RNA或DNA。3.4逆轉(zhuǎn)錄酶目前三十二頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄酶的活性目前三十三頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)用途：（1）在體外以mRNA為模板合成cDNA；（2）對有5`突出末端的DNA片段作末端標(biāo)記（補(bǔ)平）；（3）雙脫氧法測序；（4）以DNA或RNA為模板合成核酸探針。Back目前三十四頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)活性：

5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性，且3`→5`外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA強(qiáng)。

高濃度dNTP環(huán)竟下前者活性更強(qiáng)。應(yīng)用：標(biāo)記DNA平末端或隱蔽3`末端3.5T4DNA聚合酶Back目前三十五頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)活性：5`→3`聚合酶活性；有單鏈及雙鏈的3`→5`外切酶活性，但無5`→3`外切酶活性；特點(diǎn)：極佳的連續(xù)合成能力應(yīng)用：（1）用于長模板DNA的引物延伸反應(yīng)；（2）通過單純延伸或取代合成途徑標(biāo)記DNA3`末端；（3）使雙鏈DNA5`或3`突出末端變平末端。3.6T7DNA聚合酶Back目前三十六頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)4修飾酶4.1堿性磷酸酶4.2末端轉(zhuǎn)移酶4.3T4多核苷酸激酶4.4S1核酸酶

Home目前三十七頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)4.1堿性磷酸酶功能：催化核酸脫5`-磷酸基團(tuán)，使DNA或RNA片段5`-P末端轉(zhuǎn)換成5`-OH末端。來源：大腸桿菌：bacterialalkalinephosphatase(BAP);小牛腸道:calfintestinalalkalinephosphatase

(CIP)。目前三十八頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)堿性磷酸酶的活性目前三十九頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)注意：CIP的比活性比BAP高出10-20倍，且CIP在SDS中68℃就可完全失活，而BAP卻是熱抗性酶。Back目前四十頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)來源:前淋巴細(xì)胞和分化早期的類淋巴細(xì)胞。功能：催化DNA進(jìn)行5`→3`方向的聚合作用,逐個(gè)將dNTP分子加到線性DNA分子3`-OH端。4.2末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)目前四十一頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)末端轉(zhuǎn)移酶的催化作用目前四十二頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)用途：(1)(主要)給外源DNA片段和及載體加互補(bǔ)同聚物尾巴；(2)標(biāo)記DNA片段的3`末端。Back目前四十三頁\總數(shù)四十八頁\編于三點(diǎn)4.3T4多核苷酸激酶

T4polynucleotidekinase(PNK)

來源:T4噬菌體感染的大腸桿菌細(xì)胞。功能：催化γ-磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移給DNA或RNA的5`-OH末端（圖