免疫細(xì)胞的分離及檢測※檢測

免疫細(xì)胞的分離及檢測※檢測第一頁，共56頁。目錄

第一節(jié)吞噬細(xì)胞的分離和收集第二節(jié)外周血單個核細(xì)胞的分離和純化第三節(jié)淋巴細(xì)胞及其亞群的分離第二頁，共56頁。免疫細(xì)胞的分離及檢測※檢測：各類免疫細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和功能測定※方法：體外法為主※目的：判斷機(jī)體免疫狀態(tài)※意義：探討疾病的發(fā)病機(jī)制、發(fā)展、預(yù)后、療效免疫細(xì)胞的分離是指將各種參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞從血液或組織中分離出來3第三頁，共56頁。免疫細(xì)胞種類第四頁，共56頁。

﹡大吞噬細(xì)胞:即單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)

﹡小吞噬細(xì)胞:即中性粒細(xì)胞第一節(jié)吞噬細(xì)胞的分離和收集吞噬細(xì)胞的種類第五頁，共56頁。特征性標(biāo)志CD14分離技術(shù)Pecoll密度梯度分離法流式細(xì)胞儀分離技術(shù)免疫磁珠分離法：為目前較常用的方法黏附法一、吞噬細(xì)胞的分離（一）單核細(xì)胞的分離第六頁，共56頁。免疫磁珠分離法

第七頁，共56頁?！畎唑筚N法分離人巨噬細(xì)胞☆動物的巨噬細(xì)胞直接從腹腔滲出液中獲?。ǘ┚奘杉?xì)胞的分離第八頁，共56頁。聚合物加速沉降法可從外周血中分離出白細(xì)胞RBC血漿(抗凝血)WBCRBC

Ficoll分離法可從白細(xì)胞中分離出純化的中性粒細(xì)胞（三）中性粒細(xì)胞的分離第九頁，共56頁。Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離中性粒細(xì)胞第十頁，共56頁。吞噬細(xì)胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。（一）中性粒細(xì)胞功能檢測技術(shù)（二）巨噬細(xì)胞功能檢測技術(shù)二、相關(guān)功能檢測第十一頁，共56頁。細(xì)胞趨化功能的檢測吞噬功能的檢測殺菌功能的檢測（一）中性粒細(xì)胞功能檢測第十二頁，共56頁。體內(nèi)試驗(yàn)法：皮膚窗法體外試驗(yàn)法：濾膜滲透法瓊脂糖平板法趨化功能檢測——檢測細(xì)胞運(yùn)動功能皮膚窗法在受檢者前臂屈側(cè)中央3㎜范圍內(nèi)，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2，5，8，12，24，36小時各取樣一次，染色觀察中性粒細(xì)胞聚集開始時間、聚集程度等。健康正常人一般2～3h后開始聚集，達(dá)50～100個，6小時可達(dá)1000個以上。

第十三頁，共56頁。

原理及技術(shù)要點(diǎn)

在一特制的分上下兩層的小盒，將趨化因子加入下室，待檢細(xì)胞加入上室，兩室用微孔濾膜分隔，37℃溫育數(shù)小時后，上室的中性粒細(xì)胞受下室趨化因子的吸引，由濾膜微孔進(jìn)入濾膜內(nèi)，取濾膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍鏡下觀察細(xì)胞穿越濾膜的移動距離，從而判斷其趨化功能。濾膜滲透法第十四頁，共56頁。原理及技術(shù)要點(diǎn)

在瓊脂糖凝膠平板的中孔加白細(xì)胞懸液，左孔加趨化因子，右孔加對照液，溫育4～8小時后，用顯微鏡測微器測定中性粒細(xì)胞向左孔的移動距離A和向右孔的移動距離B，計算趨化指數(shù)。趨化指數(shù)=A/B趨化指數(shù)越大，表明中性粒細(xì)胞運(yùn)動功能越強(qiáng)

瓊脂糖平板法第十五頁，共56頁。顯微鏡檢查法

吞噬指數(shù)=（一）中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測第十六頁，共56頁。NBT還原試驗(yàn)

原理：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黃色）甲chan（紫黑色）殺菌功能檢測第十七頁，共56頁。

方法：1.抗凝血+硝基藍(lán)四氮唑（NBT），37℃孵育25min。2.推片染色、鏡檢。正常值：NBT陽性細(xì)胞率應(yīng)≥95%NBT還原試驗(yàn)第十八頁，共56頁。炭粒廓清試驗(yàn)

正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10％炭粒。據(jù)此給小鼠靜脈注射定量印度墨汁（炭粒懸液），間隔一定時間反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。（二）巨噬細(xì)胞功能檢測第十九頁，共56頁。Mф+CRBC孵育涂片、染色、鏡檢計算、吞噬率、吞噬指數(shù)吞噬率＝（吞噬CRBC的Mф

數(shù)/計數(shù)的Mф

數(shù)）×100％吞噬指數(shù)＝Mф吞噬的CRBC總數(shù)/計數(shù)的Mф

數(shù)吞噬功能檢測返回章目錄第二十頁，共56頁。PBMC包括：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞各種血細(xì)胞比重不同,利用密度梯度離心進(jìn)行分離常用分層液：ficoll－h(huán)ypaque，percoll第二節(jié)外周血單個核細(xì)胞的分離和純化第二十一頁，共56頁。細(xì)胞比重血小板1.030~1.035PBMC1.075~1.090多核白細(xì)胞1.092紅細(xì)胞1.093外周血各細(xì)胞成分的密度第二十二頁，共56頁。

Ficoll分離液法是一種單次差速密度梯度離心的分離法，主要用于分離外周血中的單個核細(xì)胞。原理：Ficoll分層液：密度1.077±0.001離心：密度梯度離心分離：各類細(xì)胞按其相應(yīng)密度重新分布

一、Ficoll分離法第二十三頁，共56頁。Ficoll分層液分離單個核細(xì)胞示意圖第二十四頁，共56頁。78％98％Percoll分離單個核細(xì)胞示意圖返回章目錄第二十五頁，共56頁。﹡紅細(xì)胞的去除：低滲裂解法、氯化銨裂解法﹡血小板的去除：胎牛血清梯度離心法﹡單核細(xì)胞的去除：黏附法羰基鐵吞噬法（磁鐵吸引法）苯丙氨酸甲酯去除法

第三節(jié)淋巴細(xì)胞及其亞群的分離一、淋巴細(xì)胞的純化第二十六頁，共56頁。免疫磁珠分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法其他方法二、淋巴細(xì)胞亞群的分離第二十七頁，共56頁。

原理

將針對淋巴細(xì)胞特殊表面標(biāo)志的某種特異性單克隆抗體與磁珠結(jié)合形成免疫磁珠（IMB），當(dāng)特異性單克隆抗體與表達(dá)相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞結(jié)合，利用磁場可以將IMB所結(jié)合細(xì)胞與其他細(xì)胞分離。包被磁珠的抗體可以是第一抗體或第二抗體。免疫磁珠分離法第二十八頁，共56頁。免疫磁珠分離法第二十九頁，共56頁。488nm激光+-前向散射光檢測器

熒光檢測器電磁場單個細(xì)胞被分類進(jìn)入檢測管流式細(xì)胞術(shù)分離原理示意圖第三十頁，共56頁。E花環(huán)沉降法第三十一頁，共56頁。T細(xì)胞功能檢測B細(xì)胞功能檢測NK細(xì)胞功能檢測三、相關(guān)功能檢測第三十二頁，共56頁。T細(xì)胞增殖試驗(yàn)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)MHC-肽四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測T細(xì)胞功能檢測第三十三頁，共56頁。淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)第三十四頁，共56頁。非特異性刺激物：

PHA------T細(xì)胞

ConA------T細(xì)胞

PWM------T、B細(xì)胞

LPS------B細(xì)胞特異性刺激物：異種抗原同種組織抗原淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物第三十五頁，共56頁。形態(tài)學(xué)檢查法3H-TdR摻入法MTT比色法淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的檢測方法第三十六頁，共56頁。形態(tài)學(xué)檢查法第三十七頁，共56頁。

轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞過渡型細(xì)胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征第三十八頁，共56頁。原理：刺激物37℃56hG1期→S1期

合成DNA↑

3H-TdR37℃16hDNA-3H-TdR測淋巴細(xì)胞內(nèi)放射量（cpm）計算SI判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度外周血（T）G0期3H-TdR摻入法第三十九頁，共56頁。評價：該方法敏感性高、客觀性強(qiáng)、重復(fù)性好、可自動操作；設(shè)備昂貴、放射污染。

刺激指數(shù)（stimulatingindex，SI）

SI=試驗(yàn)管cpm均值/對照管cpm均值3H-TdR摻入法第四十頁，共56頁。原理：外周血T細(xì)胞

PHA發(fā)生增殖

MTT含藍(lán)色甲顆粒

的T細(xì)胞

MTT

PHA

有機(jī)溶劑測吸光度（A）值

計算SI判定細(xì)胞增殖結(jié)果SI=(SI≧2具有意義)

MTT比色法第四十一頁，共56頁。原理:靶細(xì)胞抗原T細(xì)胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細(xì)胞（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)第四十二頁，共56頁。試驗(yàn)方法:同位素法

淋巴細(xì)胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞破壞51Cr釋放測定γ射線51Cr特異釋放率=

×100%（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)第四十三頁，共56頁。（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)背景無效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞1:1效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞5:1效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞20:1細(xì)胞溶解第四十四頁，共56頁。MHC-肽四聚體技術(shù)原理

根據(jù)T細(xì)胞活化的雙識別原理，用生物工程技術(shù)將MHC分子在體外組裝，并結(jié)合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物，結(jié)合流式細(xì)胞儀定量檢測抗原特異性T細(xì)胞。T第四十五頁，共56頁。技術(shù)要點(diǎn):

1.在體外將特異性抗原肽段、可溶性MHCI類分子重鏈及β2微球蛋白正確折疊，形成MHC-抗原肽復(fù)合物，并純化該復(fù)合物。2.用生物素標(biāo)記MHC-抗原肽復(fù)合物。3.生物素標(biāo)記的MHC-抗原肽復(fù)合物與熒光標(biāo)記的親和素以4:1的比例相混合，即得到熒光標(biāo)記的四聚體MHC-肽四聚體技術(shù)第四十六頁，共56頁。MHC-肽四聚體技術(shù)第四十七頁，共56頁。原理:用刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞，用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制如莫能霉素阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方式被打亂，引起細(xì)胞因子向高爾基體積聚，用流式細(xì)胞儀便可測出淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子種類，從而確定TH1/TH2細(xì)胞的百分率。淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測第四十八頁，共56頁。分泌的細(xì)胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++

Thl和Th2分泌的細(xì)胞因子第四十九頁，共56頁。特異性抗原皮膚試驗(yàn)PHA皮膚試驗(yàn)體內(nèi)試驗(yàn)第五十頁，共56頁。溶血空斑試驗(yàn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)體內(nèi)試驗(yàn)B細(xì)胞功能檢測第五十一頁，共56頁。溶血空斑試驗(yàn)溶血斑補(bǔ)體抗血清包被綿羊紅細(xì)胞第五十二頁，共56頁。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法抗體產(chǎn)生B細(xì)胞抗原