生化常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

第1

節(jié)

分子印跡與雜交技術(shù)

目前一頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點一、核酸分子印跡與雜交技術(shù)核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)

把不同來源而具有一定同源性的DNA分子放在同一溶液中做變性處理，或把單鏈DNA與RNA放在一起，在一定條件下，它們之間的同源區(qū)域可按堿基互補原則復(fù)性形成雜合雙鏈(heteroduplex)

，這一過程稱為雜交。目前二頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點目前三頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點

在雜交之前，通常用瓊脂糖凝膠分離待測的DNA分子，再將分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到特定的支持物上。由于轉(zhuǎn)移后各個DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置一樣，故稱為印跡（blotting）。印跡（blotting）目前四頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點（一）Southern印跡雜交

Southern印跡雜交（Southernblotting）是指DNA與DNA分子之間的雜交。其基本過程是將瓊脂糖凝膠電泳分離的待測DNA片段變性后，將凝膠中的DNA分子轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上，然后用標記的探針檢測待測的DNA。目前五頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點探針（probe）

是指經(jīng)過特殊標記的已知序列核苷酸片段，可以用來檢測某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA片段。

探針的種類

寡核苷酸基因組DNAcDNA片段

RNA片段標記物

放射性同位素生物素熒光染料

目前六頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點Southern印跡雜交的基本步驟待測DNA樣品的限制性內(nèi)切酶消化

酶切DNA樣品的電泳分離凝膠中DNA的變性和Southern轉(zhuǎn)移

探針的制備

Southern雜交

雜交結(jié)果的檢測

目前七頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點M1210×SSC

轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物支持物500g12與探針同源雜交的基因DNA片段基因組DNADNA酶切片段內(nèi)切酶NC或尼龍膜NC膜或尼龍膜目前八頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點

基因組DNA的定性與定量分析。如對在基因組中特異基因的定位及檢測等。重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。Southertblotting用途目前九頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點（二）Northern印跡雜交

利用類似于Southern印跡雜交的技術(shù)來檢測RNA稱為Northern印跡雜交（Northernblotting）。

Northern印跡雜交基本原理和過程與Southern印跡基本相同，只是檢測的分子是RNA，可用來對組織或細胞中的mRNA進行定性或定量分析。目前十頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點Northern印跡雜交的基本過程目前十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點相同點：名稱相對于Southernblotting轉(zhuǎn)移的是RNA轉(zhuǎn)移前無需酶切轉(zhuǎn)移效率較高變性方法不同點原理均為毛細作用目前十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點Northernblotting用途

檢測某一組織或細胞中已知的特異mRNA

的表達水平。比較不同組織和細胞的同一基因的表達情況。目前十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點二、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Westernblotting)

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)是根據(jù)蛋白質(zhì)分子之間存在相互作用的特點，將蛋白質(zhì)電泳分離，然后將其轉(zhuǎn)移和固定于固體支持物（NC膜或其它膜）上，再用相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子對其進行檢測。最常用的蛋白質(zhì)是抗體，因此被稱為免疫印跡（immunoblotting）技術(shù)。

目前十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點目前十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點目前十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點

首先將混合蛋白質(zhì)用PAGE按分子大小分開，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，蛋白質(zhì)的位置可保持在膠中的原位上。與DNA和RNA印跡相似之處目前十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的檢測以抗體作探針用堿性磷酸酶（ALP）、辣根過氧化酶（HRP）標記第二抗體，底物顯色來檢測蛋白區(qū)帶的信號，底物亦可與化學(xué)發(fā)光劑結(jié)合以提高敏感度?；蛴猛凰貥擞浀诙贵w，放射自顯影法檢測蛋白區(qū)帶的信號。與DNA和RNA印跡不同之處目前十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點Westernblotting應(yīng)用

檢測樣品中的特異蛋白質(zhì)的存在細胞中特異蛋白質(zhì)的定量分析蛋白質(zhì)分子的相互作用研究目前十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點三種印跡技術(shù)的比較Westernblotting垂直槽Northernblotting水平槽Southernblotting水平槽目前二十頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點第2節(jié)

PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用

（PolymeraseChainReaction，PCR）聚合酶鏈反應(yīng)目前二十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點

PCR技術(shù)是1985年由美國科學(xué)家KaryBMullis建立的體外擴增基因片段的方法，它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點，是分子生物學(xué)技術(shù)中一項具有革命性的創(chuàng)舉。

PCR方法被美國Science雜志評為1989年的十大科技成就之一，而TaqDNA聚合酶被評選為象征1989年的“年分子”(themoleculeofyear)。目前二十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55一、PCR技術(shù)的基本原理目前二十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目前二十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分目前二十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點二、PCR技術(shù)的主要特點1.特異性強2.靈敏度高3.簡便快速4.對標本的純度要求低目前二十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點2.采用PCR方法獲得目的基因

引物選擇：特異引物、隨機引物、簡并引物

1.采用RT-PCR方法擴增目的基因三、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的擴增與克隆目前二十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點（二）基因的體外定點突變（三）基因突變分析（四）DNA和RNA的微量分析（五）DNA序列測定三、PCR技術(shù)的主要用途目前二十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點(Sanger雙脫氧鏈終止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT1′3′OHαβγ5′雙脫氧核苷三磷酸脫去DNA鏈末端合成終止法Sanger1958年和1980年兩次獲Nobel獎目前二十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點DNA鏈末端合成終止法目前三十頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點目前三十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點DNA自動測序用熒光替代放射性核素標記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標記4種ddNTP，然后進行Sanger測序反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離。通過4種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出4種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。

目前三十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點DNA自動測序結(jié)果目前三十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點四、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)（二）原位PCR技術(shù)(ISP)（三）實時PCR技術(shù)(realtimePCR)目前三十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點RT-PCR技術(shù)AAnATTnT5′5′mRNA反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA3′5′3′5′5′加熱變性加入特異性引物DNA聚合酶PCR擴增出大量的產(chǎn)物目前三十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點實時PCR技術(shù)原理目前三十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點第3節(jié)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)

與基因剔除技術(shù)目前三十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點

是指將外源基因整合到動物細胞或植物細胞的基因組中并使外源基因在動物細胞或植物細胞中穩(wěn)定遺傳和表達的技術(shù)。

基因的導(dǎo)入方式主要：

顯微注射法胚胎干細胞法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前三十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點

即體細胞克隆技術(shù)，是用顯微操作、電融合等方法將動物體細胞的細胞核全部導(dǎo)入另一個個體的去除細胞核的卵細胞內(nèi)，使之發(fā)育成為個體。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)目前三十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點

核轉(zhuǎn)移技術(shù)可使一個細胞變成一個個體，這樣產(chǎn)生的個體所攜帶的遺傳物質(zhì)與細胞核供體的遺傳物質(zhì)完全一樣，是一種無性繁殖的過程，即克隆(clone)。目前四十頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點通過分子生物學(xué)的方法定向地敲除動物體細胞內(nèi)的某個基因的技術(shù)稱為基因剔除(geneknock-out)或基因打靶(genetargeting)。三、基因剔除技術(shù)目前四十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（一）建立疾病動物模型（二）生物制藥（三）治療性克隆和生產(chǎn)可用于人體器官移植的動物器官目前四十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點第4

節(jié)

生物芯片技術(shù)目前四十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點DNA芯片(DNAchip)、DNA陣列(DNAarray)cDNA芯片(cDNAchip)

指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上。一、基因芯片(genechip)目前四十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點

將探針與熒光標記的待測樣品分子進行雜交，通過檢測系統(tǒng)檢測雜交的熒光信號和強度，從而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。

目前四十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點目前四十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點

將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)又稱蛋白質(zhì)陣列

(proteinarray)目前四十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點基本原理：

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間在空間構(gòu)象上能特異性的相互識別和相互結(jié)合。如抗體與抗原或受體與配體之間的特異性結(jié)合。最常用的探針：

抗體，抗體與抗原結(jié)合的特異性最強。檢測方法：

標記檢測法、直接檢測法目前四十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點第5節(jié)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)目前四十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點1989年美國紐約州立大學(xué)的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)。該系統(tǒng)的建立是基于對酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4分子的研究。轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activationdomain)一、酵母雙雜交系統(tǒng)（一）酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理N端C端目前五十頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點

這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響,單獨存在時沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價或非共價鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個完整的激活特定基因表達的激活因子的功能。目前五十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點目前五十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點目前五十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十九點（二）酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1.分析已知蛋白質(zhì)之間的相互作用及蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域2.篩選和發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)3.篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響

4.繪制蛋白相互作用系統(tǒng)圖譜目前五十四頁\總數(shù)