環(huán)境生物技術(shù)講座北大

微生物在處理水、廢水、污泥以及受污染場(chǎng)地的生物修復(fù)中得到了廣泛的應(yīng)用。但是，生物處理過程中經(jīng)常出現(xiàn)一些故障，例如，活性污泥處理廢水過程中的污泥膨脹，厭氧消化過程中的過度酸化現(xiàn)象等，使處理工藝難以發(fā)揮最佳功效。人們對(duì)這些過程中微生物種群的組成、各種微生物所起的作用以及它們之間的相互關(guān)系尚缺乏深刻的認(rèn)識(shí)。

2001-12-8目前一頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)

傳統(tǒng)的基于微生物培養(yǎng)和純種分離的技術(shù)在研究微生物生態(tài)、描述微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性時(shí)存在諸多局限性，主要表現(xiàn)為：（1）對(duì)微生物類群進(jìn)行描述之前必須首先進(jìn)行培養(yǎng)，然而自然生境中的微生物，其大部分種類至今為止是不可培養(yǎng)的。（2）現(xiàn)有微生物分類標(biāo)準(zhǔn)具有主觀性。即使某些新發(fā)現(xiàn)的微生物種可以被培養(yǎng)，但往往與現(xiàn)行的分類標(biāo)準(zhǔn)體系不相符，而已有的對(duì)各種微生物表型的描述也常常不能滿足區(qū)分各種類群的需要。

2001-12-8目前二頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)

基于現(xiàn)代生物學(xué)的分子方法，為深入研究廢水生物處理過程中各種微生物的作用，為深刻理解廢水處理過程的本質(zhì)、提高處理系統(tǒng)的性能以及進(jìn)行工藝革新等提供了新的強(qiáng)有力的方法和手段，為我們了解這些處理系統(tǒng)中的微生物生態(tài)并對(duì)處理過程進(jìn)行工程控制提供了可能。分子生物學(xué)方法的出現(xiàn)使我們有可能更好的理解現(xiàn)有的生物處理工藝（如活性污泥法、厭氧污泥消化）以及開發(fā)新的處理工藝。

2001-12-8目前三頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)利用分子生物學(xué)方法可以直接獲得活性污泥中微生物種群的基因信息，可以為我們提供傳統(tǒng)的測(cè)量指標(biāo)，如生化需氧量（BOD）、揮發(fā)性懸浮固體（VSS）等所不能反映的一些精確信息。分子生物學(xué)方法可以跟蹤活性污泥中一些關(guān)鍵性的微生物，如絲狀菌、氨氧化菌等。我們將介紹常用的分子生物學(xué)方法在廢水生物處理微生物學(xué)研究中的一些成果及最新進(jìn)展，包括微生物的原位檢測(cè)和定量分析、廢水處理系統(tǒng)中微生物的多樣性、與污泥膨脹和產(chǎn)生泡沫有關(guān)的細(xì)菌以及脫氮除磷微生物等。2001-12-8目前四頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)分子生物學(xué)方法可以直接探詢微生物種群中我們感興趣微生物的基因信息，而這些信息是傳統(tǒng)的分析方法不可能獲得的。利用分子生物學(xué)方法可以省去對(duì)微生物的選擇培養(yǎng)以及利用形態(tài)特征進(jìn)行鑒定微生物存在的偏差。本節(jié)主要內(nèi)容1.1分子方法探詢的基因目標(biāo)1.2以rRNA為基因目標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)1.3分子信息及其應(yīng)用1分子生物學(xué)方法可以提供新的信息2001-12-8目前五頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)與建立在某些表型特性基礎(chǔ)上的細(xì)胞富集培養(yǎng)方法不同，分子方法直接針對(duì)微生物群落的基因信息，分子技術(shù)測(cè)定的是細(xì)胞DNA或RNA的堿基序列。

分子方法以不同類型的DNA或RNA為目標(biāo)，這取決于我們需要哪種信息。表1總結(jié)了檢測(cè)目標(biāo)以及每個(gè)目標(biāo)能夠提供的信息。1.1分子方法探詢的基因目標(biāo)2001-12-8目前六頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)目標(biāo)獲得的信息核糖體（r）RNA系統(tǒng)發(fā)育身份，它們是什么？DNA上編碼rRNA的基因系統(tǒng)發(fā)育身份，它們是什么？DNA上的其他基因表型潛力，它們能夠做什么？信使（m）RNA表型活性，它們正在做什么？蛋白質(zhì)或其他報(bào)告產(chǎn)物表型活性或發(fā)育系統(tǒng)身份，它們是什么？或它們正在做什么？表1分子生物學(xué)方法探詢的目標(biāo)

2001-12-8目前七頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)為了確定群落中的微生物在系統(tǒng)發(fā)育上的身份，以rRNA（通常是16SrRNA）或用于編碼rRNA的基因?yàn)榉肿訖z測(cè)的目標(biāo)。表型潛力，如對(duì)某種特殊基質(zhì)的降解能力，可以通過在DNA上尋找相關(guān)基因來進(jìn)行檢測(cè)。已經(jīng)得到表達(dá)的表型潛力可以通過檢測(cè)mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物（如酶）來證明。根據(jù)我們的研究需要，可以利用適當(dāng)?shù)姆肿臃椒▉硖皆儽?給出的基因目標(biāo)，從這些基因分析中我們可以得到所需的信息。基因探詢的目標(biāo)如圖1所示。圖1總結(jié)了微生物細(xì)胞如何將DNA中的遺傳密碼轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)分子的機(jī)制。2001-12-8目前八頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)復(fù)制基因轉(zhuǎn)錄信使RNA蛋白質(zhì)產(chǎn)物翻譯氨基酸—轉(zhuǎn)運(yùn)RNA微生物細(xì)胞內(nèi)的信息流動(dòng)示意圖DNA,mRNA,rRNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)物均可以作為分子方法探詢的基因目標(biāo)。

2001-12-8目前九頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)1.2以rRNA為基因目標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)

核糖體RNA（rRNA）是目前用于構(gòu)建生物系統(tǒng)發(fā)育樹比較可靠的基因目標(biāo)，可以為我們提供微生物群落中某一特定微生物豐度方面的信息。目前人們最常用的基因目標(biāo)是rRNA，這是基于以下原因。2001-12-8目前十頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)（1）生物細(xì)胞需要rRNA將遺傳信息翻譯成蛋白質(zhì)，因此，rRNA存在于所有的生物細(xì)胞中；（2）生物細(xì)胞內(nèi)含有大量的核糖體，因此，rRNA相對(duì)來說容易檢測(cè)到；（3）由于rRNA被包埋于核糖體中，因而相對(duì)較為穩(wěn)定；（4）細(xì)菌和古細(xì)菌的小亞單位rRNA，即通常所說的16SrRNA，大約含1600個(gè)堿基對(duì)，這1600個(gè)堿基對(duì)可以提供足夠的進(jìn)化信息，從中選擇15-20個(gè)堿基對(duì)序列的寡核苷酸片段用作探針，可以檢測(cè)和鑒定多種微生物；（5）從環(huán)境樣品中分離出rRNA并用于微生物系統(tǒng)發(fā)育、種類鑒定、多態(tài)性及多樣性研究的方法已全面建立。利用rRNA序列研究微生物群落特征的方法總結(jié)如圖2。

2001-12-8目前十一頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)利用rRNA序列研究微生物群落特征的方法

2001-12-8目前十二頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)1.3分子信息及其應(yīng)用

從圖1可以看出，微生物細(xì)胞擁有一個(gè)復(fù)雜的信息流動(dòng)網(wǎng)絡(luò)，并用來決定其類型和控制其行為。這些信息在DNA中編碼。DNA編碼的基因并不實(shí)際承擔(dān)任何細(xì)胞工作，如能量產(chǎn)生或合成。相反，它們通過精確的、多步驟機(jī)制解碼DNA上的信息，并最終生成各種工作分子，如催化細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)需要的酶。

2001-12-8目前十三頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)目前常用的分子方法有:2.1核酸雜交2.2變性梯度凝膠電泳2.3限制性片段長度多態(tài)性2.4報(bào)告基因法2常用的分子生物學(xué)方法2001-12-8目前十四頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2.1核酸分子雜交技術(shù)探針是能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性結(jié)合的己知堿基序列的核酸片段。它可以是長探針（100-1000bp），也可以是短核苷酸片段（10-50bp），可以是從RNA制備的cDNA探針，也可以是PCR產(chǎn)物或人工合成的寡核苷酸探針。探針既可用放射性核苷酸標(biāo)記，也可用非放射性分子標(biāo)記。核酸分子雜交的高度特異性以及檢測(cè)方法的高度靈敏性，使核酸分子雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)環(huán)境中的微生物，并對(duì)它們的存在、分布、豐度和適應(yīng)性等進(jìn)行定性和定量分析。

2001-12-8目前十五頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)

核酸雜交的主要步驟是核酸分子的變性和選擇性退火。雙鏈DNA或處于二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA分子通過變性回復(fù)到它們?cè)瓉淼膯捂?、線性形式，從而使它們處于能與互補(bǔ)的核苷酸鏈退火雜交的狀態(tài)。雜交實(shí)驗(yàn)中所用到的核酸探針通常以需要檢測(cè)的核酸序列為基礎(chǔ)，它們可以來自DNA、RNA、寡核苷酸或cDNA等。2001-12-8目前十六頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)核酸雜交以堿基配對(duì)原理為基礎(chǔ)，利用寡核苷酸探針與靶細(xì)胞專一性結(jié)合進(jìn)行生物分析。核酸雜交的基本實(shí)驗(yàn)步驟為：細(xì)胞固定、雜交（專一性和嚴(yán)格性依賴于雜交溫度和時(shí)間、鹽濃度、探針長度及其濃度）、洗脫（去除與靶細(xì)胞沒有結(jié)合和非專一性結(jié)合的物質(zhì)）和檢測(cè)，如下圖所示。2001-12-8目前十七頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)核酸雜交的步驟

2001-12-8目前十八頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)核酸雜交試驗(yàn)并不要求探針與目標(biāo)核酸序列之間百分之百地互補(bǔ)。有限數(shù)目的非互補(bǔ)堿基對(duì)的存在是可以接受的?；パa(bǔ)的單鏈核苷酸分子經(jīng)退火形成核酸雙鏈分子的過程是可逆的。因此，可以通過改變反應(yīng)的物理和化學(xué)環(huán)境（條件）從而增加核酸雙鏈分子生成的速度、程度及其穩(wěn)定性。影響兩段互補(bǔ)核苷酸鏈雜交的因素包括：雜交和洗膜的溫度、雜交時(shí)間、離子強(qiáng)度、甲酰胺濃度、堿基對(duì)之間非互補(bǔ)的程度以及探針分子和靶核酸序列的長度、復(fù)雜性和濃度等。

2001-12-8目前十九頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)利用核酸雜交技術(shù)研究環(huán)境樣品中的微生物具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）核酸可以直接從樣品中提取，不必對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)；（2）不管基因表達(dá)與否，都可以檢測(cè)到特定的基因或核酸序列，從而能準(zhǔn)確地跟蹤、監(jiān)測(cè)特定的微生物種群。通常，一份環(huán)境樣品中可能只有一小部分的微生物類群在迅速生長，因而也只有一小部分的基因在活躍表達(dá)，在這種情況下，核酸雜交技術(shù)的這一優(yōu)點(diǎn)更加明顯；（3）利用同一樣品可以同時(shí)檢測(cè)到眾多不同的微生物類群。實(shí)際上，核酸雜交的檢測(cè)效率隨著所分析的微生物類群的增加而提高；（4）由于可以直接檢測(cè)到特定的核酸序列，因此該方法并不要求一定要有選擇性表型（即突變衍生物），這就避免了野生種的生態(tài)適應(yīng)性被營養(yǎng)缺陷型所抵消的問題。

2001-12-8目前二十頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2001-12-8目前二十一頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)

核酸雜交技術(shù)在環(huán)境中應(yīng)用的一個(gè)重要局限就是它要比傳統(tǒng)的方法復(fù)雜得多。（1）從各種環(huán)境樣品中提取核酸本身就包含眾多繁冗的抽提和純化操作，因此也是最復(fù)雜的步驟之一。（2）從富含能干擾核酸檢測(cè)的污染物的樣品（如土壤）中回收核酸，仍有待用一些特殊的技巧對(duì)現(xiàn)行的有關(guān)方法加以改善。（3）對(duì)任何一個(gè)自然微生物群落的研究常常需要對(duì)其多個(gè)平行樣品進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)，而目前要用核酸雜交技術(shù)分析如此眾多的樣品實(shí)際上相當(dāng)困難。準(zhǔn)確估算樣品中有關(guān)基因的拷貝數(shù)的方法尚有待進(jìn)一步建立。（4）從諸如水樣等樣品中檢測(cè)到以很低豐度存在的、或在整個(gè)微生物群落中僅占很小比例的微生物類群，核酸雜交技術(shù)的靈敏度尚需大幅度提高。而要將特定的微生物或核酸序列從富含與它親緣關(guān)系較近的其它微生物的背景中檢測(cè)出來，也要求一些特殊的方法。

2001-12-8目前二十二頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)核酸雜交技術(shù)的一個(gè)缺點(diǎn)是只有對(duì)已被分離并已測(cè)序的微生物才能夠放心使用。微生物生態(tài)學(xué)家估計(jì)在自然界中到目前為止，只有少數(shù)微生物能夠被分離、培養(yǎng)。此外，被分離的微生物也可能并不能很好地代表自然環(huán)境中最重要的微生物。無論微生物是否已被分離或已完成測(cè)序，具有能提供微生物群落多樣性指紋信息的分子技術(shù)是非常有用的。2001-12-8目前二十三頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)變性梯度凝膠電泳法（DGGE）是一種使用日益廣泛的方法。在DGGE方法中，DNA在含聚丙烯酰胺凝膠電泳池的一端。電泳池兩端的電極形成一個(gè)電場(chǎng)，吸引帶負(fù)電的DNA向正極運(yùn)動(dòng)。DNA分子的移動(dòng)速率取決于其分子大小與帶電量之間的比值，因此，不同的DNA分子運(yùn)動(dòng)到兩個(gè)電極之間的不同位置上停下，從而形成具有指紋作用的DNA帶。將DNA帶從凝膠中分離出來，可以進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)增及測(cè)序。

2.2變性梯度凝膠電泳法（DGGE）2001-12-8目前二十四頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)DGGE法的原理如果不斷增加溫度或用化學(xué)變性劑處理，DNA雙鏈分子的兩條鏈就會(huì)開始分開（解鏈）。首先解鏈的區(qū)域由解鏈溫度較低的堿基組成。G.C堿基對(duì)比A.T堿基對(duì)結(jié)合得要牢固，因此G.C含量高的區(qū)域具有較高的解鏈溫度。同時(shí)影響解鏈溫度的因素還有相鄰堿基間的吸引力（稱作“堆積”）。解鏈溫度低的區(qū)域，通常位于端部，稱作低溫解鏈區(qū)（lowermeltingdomain）。如果端部分開，那么雙螺旋就由未解鏈部分束在一起，這一區(qū)域便稱作高溫解鏈（highmeltingdomain）(下圖)。如果溫度或變性劑濃度繼續(xù)升高，兩條鏈就會(huì)完全分開。

2001-12-8目前二十五頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2001-12-8目前二十六頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2001-12-8目前二十七頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析是另一種指紋分析方法。該法利用限制性內(nèi)切核酸酶將被擴(kuò)增的DNA切成片段，限制性酶對(duì)DNA的剪切能避開靶基因區(qū)。靶基因周圍的側(cè)翼區(qū)中具有不同數(shù)目的酶切位點(diǎn)。因此，限制性酶切后得到的DNA片段的大小不同，能夠通過電泳分離。

2.3限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）2001-12-8目前二十八頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)報(bào)告基因法為評(píng)價(jià)已表達(dá)的表型潛力提供了另一條途徑。在報(bào)告基因法中，利用重組技術(shù)將報(bào)告基因插入DNA分子上的目標(biāo)區(qū)域。當(dāng)DNA序列被轉(zhuǎn)錄時(shí)，報(bào)告基因也同時(shí)被轉(zhuǎn)錄。來自報(bào)告基因的mRNA被翻譯成能催化某些易于檢測(cè)的反應(yīng)的酶。發(fā)光是最常見的報(bào)告基因效應(yīng)，其中綠色熒光蛋白（GFP）最為常用。只有當(dāng)完整序列被轉(zhuǎn)錄時(shí)才能觀察到報(bào)告基因效應(yīng)，因此，報(bào)告基因的表達(dá)意味著目標(biāo)基因的表達(dá)。報(bào)告基因法可以對(duì)已表達(dá)的表型進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定，其應(yīng)用前景十分可觀。2.4報(bào)告基因法2001-12-8目前二十九頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)GFP

綠色熒光蛋白作為新一代的基因轉(zhuǎn)移報(bào)告物或定位標(biāo)記物，在環(huán)境微生物研究中越來越受到關(guān)注，GFP的優(yōu)點(diǎn)：（1）不需加任何底物，經(jīng)激發(fā)后即可產(chǎn)生熒光，且熒光性質(zhì)穩(wěn)定；（2）相對(duì)分子質(zhì)量小，對(duì)細(xì)胞無毒性；（3）檢測(cè)方便，可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)定位觀察；（4）已有多種GFP突變蛋白，熒光特性得到明顯改善。2001-12-8目前三十頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2001-12-8目前三十一頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2001-12-8目前三十二頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2001-12-8目前三十三頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2001-12-8目前三十四頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)3.1活性污泥中微生物多樣性研究3.2絲狀細(xì)菌的研究3.3脫氮微生物的研究3.4除磷微生物的研究3分子方法的應(yīng)用2001-12-8目前三十五頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)自1995年以來，基于16SrRNA基因庫分析，人們對(duì)活性污泥和生物膜處理系統(tǒng)中微生物多樣性進(jìn)行了較廣泛的研究。大量的16SrRNA基因序列研究表明，這些處理系統(tǒng)中最常出現(xiàn)的微生物主要有-、-和-Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria。這些發(fā)現(xiàn)與利用熒光原位雜交（FISH）研究活性污泥系統(tǒng)得出的結(jié)果一致。利用16SrRNA數(shù)據(jù)庫還可以預(yù)測(cè)在所分析的系統(tǒng)中存在的細(xì)菌種屬。盡管從廢水處理反應(yīng)器中得到的16SrRNA基因克隆非常多，但是，對(duì)于實(shí)際廢水處理廠的微生物分析還沒有足夠的數(shù)據(jù)。

3.1活性污泥中微生物多樣性的研究

2001-12-8目前三十六頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)此外，一些復(fù)雜系統(tǒng)中實(shí)際的微生物種群組成不能夠僅僅根據(jù)16SrRNA基因庫來推測(cè)，而必須根據(jù)定量FISH分析結(jié)果來確定。定量FISH方法還很少用于研究實(shí)際廢水處理廠中微生物的種群結(jié)構(gòu)，這可能是由于對(duì)不同探針標(biāo)記的微生物在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)非常費(fèi)事，且技術(shù)上也有一些困難。半自動(dòng)數(shù)字圖像分析方法極大地加快了定量FISH的分析速度，并且使微生物學(xué)家第一次得到了活性污泥中微生物種群組成的高清晰度的、完整的圖像。2001-12-8目前三十七頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)3.2

絲狀細(xì)菌的研究

在活性污泥中存在一定數(shù)量的絲狀菌對(duì)于污泥絮體的形成是重要的，但是，出現(xiàn)大量的絲狀菌對(duì)于廢水處理則是有害的，因?yàn)樗鼈儠?huì)導(dǎo)致在污泥中形成泡沫、或者使二沉池中活性污泥的沉降性變差（引起污泥膨脹）。許多絲狀細(xì)菌難于培養(yǎng)，因此，人們對(duì)于絲狀菌了解不多，目前僅有一些在顯微鏡下可以觀察到的特征。據(jù)報(bào)道，人們?cè)谔幚砩钗鬯膹U水處理廠觀察到了30多種不同形態(tài)特征的絲狀菌，在處理工業(yè)廢水的活性污泥廠又觀察到了約40多種其他形態(tài)特征的絲狀菌。

2001-12-8目前三十八頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)利用透視電子顯微鏡（TEM）和定量FISH技術(shù)可以研究活性污泥中的絲狀菌。利用顯微操作技術(shù)富集和分離絲狀微生物，然后進(jìn)行16SrRNA基因序列分析。研究結(jié)果清楚地表明，一些分類學(xué)上相距較遠(yuǎn)的細(xì)菌通常具有在光學(xué)顯微鏡下難于分辨的相同形態(tài)特征。因此，對(duì)絲狀菌根據(jù)其形態(tài)特征進(jìn)行分類提出了強(qiáng)烈的置疑。在活性污泥中，有些絲狀菌可以呈現(xiàn)出非絲狀菌的生長形式。因此，僅僅根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行鑒定有時(shí)是不可靠的。

2001-12-8目前三十九頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)基于絲狀菌的16SrRNA基因序列，人們開發(fā)出了一套用于直接鑒定活性污泥中絲狀菌的定向于rRNA的寡核苷酸探針。利用寡核苷酸探針和抗體染色技術(shù)，可以定量地研究活性污泥中絲狀菌與污泥形成泡沫的關(guān)系。

2001-12-8目前四十頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2001-12-8目前四十一頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2001-12-8目前四十二頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2001-12-8目前四十三頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)改進(jìn)絲狀菌的原位鑒定和定量分析方法，開發(fā)絲狀菌的有效控制技術(shù)，都需要進(jìn)一步了解這些微生物生態(tài)生理方面的知識(shí)。

2001-12-8目前四十四頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)氨氮是生活污水中主要的含氮化合物（尿素極易水解形成氨），在污水處理廠中通過微生物的硝化和反硝化作用去除。盡管在教科書中仍然認(rèn)為，Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterspp.是主要的氨氧化細(xì)菌和亞硝酸氧化細(xì)菌，但是，實(shí)際情況要復(fù)雜得多。

3.3

脫氮微生物的研究

2001-12-8目前四十五頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)氨氧化過程涉及的酶

NH4+

氧化為NO2-的過程需要經(jīng)過2個(gè)步驟：

2H++NH4++2e-+O2NH2OH+H2O+2H+NH2OH+H2OHONO+4e-+4H+上述2個(gè)反應(yīng)分別由氨單氧合酶（ammoniamonooxygenase，AMO）和羥胺氧化還原酶（hydroxylamineoxidoreductase，HAO）催化，其中AMO催化NH3

氧化為NH2OH的反應(yīng)，HAO催化NH2OH氧化為NO2-的反應(yīng)（見圖）。在細(xì)胞內(nèi)（invivo）和細(xì)胞外（invitro）進(jìn)行的一系列研究使我們獲得了關(guān)于AMO和HAO的結(jié)構(gòu)與活性方面的大量信息。

2001-12-8目前四十六頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)氨氧化途徑及其相關(guān)基因

2001-12-8目前四十七頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)氨單氧合酶（AMO）

AMO是一種細(xì)胞膜結(jié)合酶，類似于顆粒甲烷單氧合酶（pMMO）。許多間接證據(jù)表明，在N.europaea以及其它可能的Proteobacteria的L和Q亞類自養(yǎng)菌中，AMO包含3個(gè)亞單位，AMO-A,AMO-B和AMO-C，其結(jié)構(gòu)和大小各不相同，位于細(xì)胞的細(xì)胞膜/壁膜間隙中。在含14C標(biāo)記的14C2H2中培養(yǎng)N.europaea細(xì)胞時(shí)，AMO的活性會(huì)喪失，一個(gè)27-kDa的多肽（AmoA）被標(biāo)記。因此，人們認(rèn)為AmoA中有氧化NH3的催化位點(diǎn)。對(duì)N.europaea中編碼氨單氧合酶的基因測(cè)序結(jié)果表明，第2個(gè)多肽（AmoB;38kDa）可以與AmoA一起純化。關(guān)于AMO的第3個(gè)多肽（AmoC;31.4kDa）的信息是間接的。對(duì)Nitrosomonaseuropaea和Nitrosospirasp.NpAV中amoC，amoA,和amoB基因的轉(zhuǎn)錄研究結(jié)果表明，AmoC，AmoA和AmoB的基因一起轉(zhuǎn)錄到單鏈mRNA中。2001-12-8目前四十八頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)AMO除可以氧化NH3以外，還可以氧化一系列的底物，將C-H鍵氧化成醇，將C=C鍵氧化成環(huán)氧化合物。反應(yīng)底物包括烷烴、芳烴、鹵代烴等。這為生物修復(fù)受氯代烴污染的環(huán)境提供了一種新的途徑。2001-12-8目前四十九頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)Nitrosomonas細(xì)胞內(nèi)由AMO催化的幾種反應(yīng)

2001-12-8目前五十頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)羥胺氧化還原酶（HAO）

羥胺氧化還原酶的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，該酶以溶解態(tài)位于壁膜間隙，但定位在胞質(zhì)膜中，為64-kDa亞單位的同源三聚體，每一個(gè)亞單位包含8個(gè)c-型的血紅素。其中7個(gè)血紅素通過c-型的血紅素典型的硫醚鍵與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。第8個(gè)血紅素為P460，另外還有一個(gè)通過酪氨酸殘基與蛋白質(zhì)相連的共價(jià)鍵，位于NH2OH氧化的活性部位。HAO的晶體結(jié)構(gòu)顯示了每一個(gè)亞基中血紅素的定向以及電子在酶中流動(dòng)的潛在途徑。2001-12-8目前五十一頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)在AMO催化的反應(yīng)中，O2中的一個(gè)O原子插入NH3分子中，另一個(gè)O原子被還原成H2O，該反應(yīng)需要2個(gè)額外的電子。因?yàn)镹H3分子是這些細(xì)菌的唯一還原劑來源，所以生成H2O分子需要的電子必須來自NH2OH分子的隨后氧化。在HAO催化氧化NH2OH分子過程中釋放的4個(gè)電子中，2個(gè)電子流向NH3的氧化，剩下的2個(gè)電子用于其他的需要還原劑的細(xì)胞過程，如細(xì)胞生物合成和ATP的形成。2001-12-8目前五十二頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)酶功能的調(diào)節(jié)

氨氧化代謝產(chǎn)物NO2-對(duì)Nitrosomonaseuropaea

細(xì)胞中AMO活性的影響研究結(jié)果表明，NO2-對(duì)AMO活性有抑制作用，從而對(duì)Nitrosomonaseuropaea細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。Nitrosomonaseuropaea細(xì)胞中的亞硝酸鹽還原酶（nitritereductase，NirK）并不是產(chǎn)生氣體氮氧化物所必需的。借助于周質(zhì)的含銅亞硝酸鹽還原酶，微生物細(xì)胞可以克服NO2-產(chǎn)生的部分負(fù)面影響，提高微生物對(duì)NO2-的忍耐能力。NO2-可以刺激Nitrosomonaseuropaea細(xì)胞中的NH3氧化反應(yīng)。氨限制會(huì)導(dǎo)致Nitrosomonaseuropaea細(xì)胞喪失AMO活性，但是，細(xì)胞的其他功能，如HAO活性保持不變。

2001-12-8目前五十三頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄、翻譯和后翻譯水平上，氨對(duì)AMO活性的調(diào)節(jié)研究表明，利用RT-PCR，可以在相同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中檢測(cè)出3種amo

基因的所以產(chǎn)物，這表明amoC

是amo操縱子的一部分。在Nitrosomonaseuropaea

細(xì)胞中，amo以及hao的轉(zhuǎn)錄受氨分子的誘導(dǎo)。但是在氨饑餓條件下，這些基因的mRNA在8小時(shí)內(nèi)會(huì)消失。通過蛋白質(zhì)印跡（westernblot）和酶活性測(cè)量等研究表明，在氨饑餓的Nitrosomonaseuropaea

細(xì)胞中，HAO可以保持穩(wěn)定長達(dá)72小時(shí)。在自然界中，即使在氨濃度波動(dòng)的條件下，氨氧化的2種關(guān)鍵酶，AMO和HAO，仍然可以保持穩(wěn)定。2001-12-8目前五十四頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)氨氧化酶的基因

氨單氧合酶基因AMO的3個(gè)多肽由3個(gè)相鄰的基因amoC，amoA

和amoB編碼（圖1）。在N.europaea

的基因組中，AMO在2個(gè)幾乎相同的（>99%）拷貝中。其他的NH3-氧化細(xì)菌（如Nitrosomonascryotolerans，Nitrosococcusoceanus，Nitrosospirasp.NpAV）的amo基因與N.europaea的amo基因高度相似。在不同的NH3-氧化細(xì)菌中，基因蔟amoCAB出現(xiàn)在3個(gè)拷貝中。在生長的N.europaea細(xì)胞中可以檢測(cè)出AMO的3個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，分別對(duì)應(yīng)于amoC，amoAB和

amoCAB

。關(guān)于AMOmRNAs的知識(shí)目前還不太了解，它們可能來自amoCABmRNA的加工，也可能來自amoC和amoA的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)在amoC起始密碼子上游的166和103bp處，以及在amoC和amoA基因間區(qū)中amoA起始密碼子上游114bp處。

2001-12-8目前五十五頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)羥胺氧化還原酶基因

編碼羥胺氧化還原酶的基因hao，長度為1710bp，表達(dá)為單順反子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。該基因也編碼18–24氨基酸前導(dǎo)序列，特別是周質(zhì)蛋白質(zhì)，它們?cè)贖AO的轉(zhuǎn)運(yùn)和成熟期間被去除。N.europaea的基因組包含3個(gè)分隔的HAO基因拷貝。除了在一個(gè)基因拷貝中有1個(gè)核苷酸差別外，hao基因3個(gè)拷貝的編碼區(qū)域是相同的。2001-12-8目前五十六頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)用于氨氧化菌多樣性分析的分子生物學(xué)方法是基于amoA基因（編碼所有氨氧化細(xì)菌中氨單加氧酶亞單位的活性位點(diǎn)）和/或16SrRNA基因分析。200余個(gè)

amoA基因片斷的比較序列分析結(jié)果顯示，屬于-Proteobacteria的各種氨氧化菌大量存在于廢水處理廠的硝化活性污泥中，除N.europaea,Nitrosomonaseutropha,Nitrosococcusmobilis外，還有Nitrosomonasmarina等。amoA分析結(jié)果表明，與其它生態(tài)系統(tǒng)不一樣，在這些硝化活性污泥中，Nitrosospira屬的氨氧化菌并不重要。這些發(fā)現(xiàn)與氨氧化菌種群組成的定量FISH分析結(jié)果是一致的。2001-12-8目前五十七頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)值得注意的是，非生理活性的氨氧化菌也能夠被FISH方法檢測(cè)出，因?yàn)檫@些細(xì)菌即使在不利的環(huán)境條件下，細(xì)胞內(nèi)也會(huì)有高含量的核糖體。利用MAR-FISH技術(shù)和14C同位素標(biāo)記的碳酸氫鹽作底物，可以精確地測(cè)定生理活性的氨氧化菌。最近，利用定量PCR技術(shù)和FISH技術(shù)，人們完成了氨氧化菌的分子工具箱。據(jù)此，可以推測(cè)出復(fù)雜樣品，包括活性污泥中這些細(xì)菌的絕對(duì)細(xì)胞濃度。這些方法，如果與專一性合適的引物或探針結(jié)合，可以成為非常有價(jià)值的工具，用于確定廢水處理廠設(shè)計(jì)和運(yùn)行中的一些重要參數(shù)。2001-12-8目前五十八頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)分子生物學(xué)分析結(jié)果表明，在大多數(shù)廢水處理廠中，Nitrospira-類，而不是Nitrobacterspp.，是占優(yōu)勢(shì)的亞硝酸氧化菌。最新研究表明，在其它生態(tài)系統(tǒng)，如飲用水配水系統(tǒng)或土壤中，這些Nitrospira-類亞硝酸氧化菌也起著重要作用。2001-12-8目前五十九頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)MAR-FISH技術(shù)分析活性污泥中被標(biāo)記為紅色的Nitrospira-類亞硝酸鹽氧化菌的照片2001-12-8目前六十頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2001-12-8目前六十一頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)2001-12-8目前六十二頁\總數(shù)六十九頁\編于十六點(diǎn)許多水域發(fā)生的水體富營養(yǎng)化使人們對(duì)硝化過程的研究越來越深入，氨氧化反應(yīng)是硝化過程的關(guān)鍵步驟?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為氨氧化細(xì)菌的研究提供了有力的工具，人們對(duì)氨氧化微生物的生物化學(xué)和分子生