第5章植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)

主要內(nèi)容原生質(zhì)體的概念原生質(zhì)體培養(yǎng)的優(yōu)越性原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的培養(yǎng)

目前一頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露球形細(xì)胞。目前二頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)一、植物原生質(zhì)體的特點(diǎn)：1、吸收能力增強(qiáng)：易于攝取外來遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)菌、病毒等；易于吸收氧、養(yǎng)分；2、具有全能性：具有全套的遺傳物質(zhì)，具有細(xì)胞壁再生并能進(jìn)行人工培養(yǎng)分化發(fā)育成完整植株的能力；

3、在一定條件下可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，形成雜種細(xì)胞。目前三頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)4、分泌能力提高去除了細(xì)胞壁的擴(kuò)散障礙，使細(xì)胞膜的透過性增強(qiáng)，利于胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。5、穩(wěn)定性較差失去了細(xì)胞壁的保護(hù)作用，穩(wěn)定性較差，易于受到滲透壓等條件變化的影響。目前四頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)原生質(zhì)體用途信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞壁合成機(jī)理膜的結(jié)構(gòu)與功能核質(zhì)關(guān)系雜交或自交不親和的機(jī)理細(xì)胞間的相互作用植物激素的作用機(jī)理融合產(chǎn)生體細(xì)胞雜種分離各種細(xì)胞器引入各種細(xì)胞器導(dǎo)入外源基因誘發(fā)突變體目前五頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)

二、原生質(zhì)體的制備

不同的植物細(xì)胞，由于細(xì)胞壁的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有所不同，原生質(zhì)體的制備方法也不一樣。

1、用于分離原生質(zhì)體的材料準(zhǔn)備：選取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞。

無菌試管苗葉片

上胚軸和子葉

培養(yǎng)細(xì)胞（愈傷組織）目前六頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)2、原生質(zhì)體的分離1）、機(jī)械法2）、酶解法目前七頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)1）、機(jī)械法1892年首先用于藻類分離原生質(zhì)體做法：先使細(xì)胞質(zhì)壁分離，再用刀把細(xì)胞壁切破，使原生質(zhì)體流出或釋放出來。目前八頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：該方法可避免酶制劑對(duì)原生質(zhì)體的破壞作用。缺點(diǎn)：1)手工操作難度大，原生質(zhì)體得率低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以大量制備。2）能夠用此法產(chǎn)生原生質(zhì)體的植物種類受到限制。目前九頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)2）、酶解法1960年英國諾丁漢大學(xué)的科金第一次用酶解法從番茄幼苗根尖中大量制備出原生質(zhì)體；常用酶：纖維素酶類、果膠酶類、半纖維素酶、蝸牛酶等；優(yōu)點(diǎn)：條件溫和、原生質(zhì)體完整性好、活力高、得率高，而且?guī)缀跛械闹参锘蛩鼈兊钠鞴俳M織或細(xì)胞均可用酶解法獲得原生質(zhì)體。缺點(diǎn)：酶制劑中均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)，影響所獲原生質(zhì)體的活力。目前十頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)酶解制備原生質(zhì)體過程1)、取材消毒2)、酶解制備3)、原生質(zhì)體收集目前十一頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)A、酶溶劑及其滲透壓酶的種類、

酶溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制、PH値。

滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。B、酶解時(shí)間：酶濃度及溫度酶解考慮因素：目前十二頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)3、原生質(zhì)體的收集和純化：目前十三頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)1）沉淀法：篩網(wǎng)過濾除去未消化的細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)和碎片后在適當(dāng)試劑內(nèi)低速離心。

優(yōu)缺點(diǎn)：

比較簡(jiǎn)單

但不易除盡一些完整的細(xì)胞，或引起原生質(zhì)的破碎目前十四頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)2）飄浮法：據(jù)原生質(zhì)體比重小能在一定滲透壓的溶液（如25%的蔗糖）中漂浮得到收集。

優(yōu)缺點(diǎn)：可以得到較為純凈、完整的原生質(zhì)體，但完好的原生質(zhì)體數(shù)量較少目前十五頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)3）沉淀法和飄浮法結(jié)合：先沉淀后漂浮，重復(fù)操作，純化后可用于培養(yǎng)或細(xì)胞融合。目前十六頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)4）界面法采用兩種比重不同的溶液，使原生質(zhì)體處于兩液相的界面之中優(yōu)缺點(diǎn)：可以收到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時(shí)避免收集過程中原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎目前十七頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)

目的：檢驗(yàn)獲得的原生質(zhì)體是否真正的原生質(zhì)體

鑒定方法(針對(duì)有無細(xì)胞壁)：4、原生質(zhì)體鑒定低滲爆破法：原生質(zhì)體在低滲溶液中吸水脹破，觀察有無細(xì)胞壁碎片；熒光染色法：通過熒光增白劑染色后離心去除多余染料，在熒光顯微鏡下觀察（波長(zhǎng)3600-4400?），綠光顯示有纖維素，紅光示真正的原生質(zhì)體。目前十八頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)5、原生質(zhì)體活力檢測(cè)染色法

FDA法：FDA（二乙酸熒光素）能穿越細(xì)胞質(zhì)膜，被活細(xì)胞內(nèi)的酯酶裂解，在熒光顯微鏡下發(fā)熒光（熒光素）。

伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過質(zhì)膜，但質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞使細(xì)胞被染色。胞質(zhì)環(huán)流法：是否存在胞質(zhì)環(huán)流判斷原生質(zhì)體活力；滲透壓變化法：活原生質(zhì)體會(huì)隨著外界滲透壓的變化體積變化氧電極法：活原生質(zhì)體在光照下光合放氧，無光呼吸耗氧目前十九頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)例子:植物（煙草）葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的分離1).材料的準(zhǔn)備與消毒：2).酶解：3).純化：4).原生質(zhì)體的活力測(cè)定目前二十頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)1).材料的準(zhǔn)備與消毒選取在溫室中生長(zhǎng)兩個(gè)月左右的煙草植株從生長(zhǎng)健康的植株上摘取充分展開的嫩葉片經(jīng)自來水沖洗干凈后放入70%乙醇中進(jìn)行表面消毒然后再放入2%次氯酸鈉溶液中處理10分鐘接著用無菌水洗滌3~4次，以充分除去消毒劑目前二十一頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)2).酶解用一把尖鑷子，小心撕去葉片的下表皮，將葉片切成2cm長(zhǎng)的小片，然后放入含酶溶液中處理。（注意：使撕去表皮的一面朝下，溫度25~28℃下經(jīng)3-4小時(shí)的酶解反應(yīng)，其間輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿若干次）目前二十二頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)3).純化將酶解懸浮液通過300-400目網(wǎng)，以除去大的未消化的碎片然后將含有原生質(zhì)體的酶液收集在離心管中，低速離心，使原生質(zhì)體沉于管底，傾去上清液在離心管中加入適量洗滌液，再離心；重復(fù)此步驟3次，使酶解液充分除去；最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液離心一次目前二十三頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)6、影響原生質(zhì)體活力的因素：分離材料的生理狀態(tài)；酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶溶液的滲透壓；分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時(shí)間；環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響。目前二十四頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)二、原生質(zhì)體的培養(yǎng)一）、培養(yǎng)基1．滲透壓常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生質(zhì)體的滲透壓原則：培養(yǎng)基滲透壓與細(xì)胞滲透壓等滲。2．無機(jī)鹽3．有機(jī)成分維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。4．激素常用的激素：NAA、IAA、BA與2,4-D5．pH值目前二十五頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)二）原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)固體培養(yǎng)液體－固體雙層培養(yǎng)瓊脂糖珠培養(yǎng)目前二十六頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)目前二十七頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)三）影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素基因型：如番茄與秘魯番茄有性雜交后對(duì)性狀分離的遺傳分析，證明其愈傷組織的再生能力是2個(gè)顯性基因所決定；原生質(zhì)體的來源：供體材料體類型、供體細(xì)胞的分化程度、供體細(xì)胞的生長(zhǎng)同步性；起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基：基本起始密度、培養(yǎng)基激素水平、密度與培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分完全性。目前二十八頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)三、原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生完整細(xì)胞植物組織原生質(zhì)體植物細(xì)胞去壁植株再生？愈傷組織胚狀體？？目前二十九頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)一般包括如下幾個(gè)步驟：

1）細(xì)胞壁再生：體積膨大，葉綠體重新排列，新的細(xì)胞壁開始合成，細(xì)胞由球形變成橢圓形。目前三十頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)2）分裂：一般在培養(yǎng)2-3天后細(xì)胞質(zhì)增加，細(xì)胞器增殖，DNA、蛋白質(zhì)等合成增加，細(xì)胞分裂，形成小的細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育成愈傷組織或胚狀體。3）植株再生目前三十一頁\總數(shù)三十四頁\編于十三點(diǎn)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的應(yīng)用1、利用原生質(zhì)體融合獲得融合細(xì)胞2、利用原生質(zhì)體進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)化3、利用原生質(zhì)體再生植株4、利用固定化原生質(zhì)體培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物較多的分泌產(chǎn)物5