ELISA試劑的選用和質(zhì)檢

ELISA試劑的選用和質(zhì)檢

衛(wèi)生部臨床檢驗中心王露楠影響試劑盒質(zhì)量的因素試劑盒的選用試劑盒的質(zhì)檢方法目前試劑盒存在的問題影響試劑盒質(zhì)量的因素1．原材料(1)固相材料商品ELISA試劑盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板，其對ELISA試劑盒的影響在于孔間的顯色差異。(2)抗原--自然抗原、合成抗原和基因重組抗原。純度：純度不高可致試劑盒的特異性不強(qiáng)。立體結(jié)構(gòu)：合成抗原一般都是多肽抗原，缺乏完整抗原所具有的立體結(jié)構(gòu)決定簇，用于相應(yīng)的抗HCV和抗HIV抗體的檢測有可能導(dǎo)致結(jié)合上述決定簇的抗體漏檢。影響試劑盒質(zhì)量的因素(3)抗體多克隆抗體(多抗)：制備簡單，含針對抗原的多種決定簇，但抗體的親和力和特異性相對要低于單抗，且每次制備的抗體在其親和力和特異性上均有區(qū)別。單克隆抗體(單抗)：可無限大量的得到針對單一決定簇的抗體，缺點是結(jié)合的單一性。當(dāng)建立雙抗夾心ELISA測定方法時，如包被和指示抗體使用同一單抗，則由于結(jié)合位點的缺乏，很容易造成假陰性結(jié)果，尤其是在使用一步法時“鉤狀”效應(yīng)(Hookeffect)的出現(xiàn)。因此，在使用單抗建立雙抗夾心ELISA方法時，包被和指示抗體常使用針對抗原的不同決定簇的單抗，包被抗體可為混合單抗，從而使得固相抗體在免疫測定中能更為完全地結(jié)合待測物中的特異抗原。影響試劑盒質(zhì)量的因素(4)酶結(jié)合物ELISA試劑盒的核心部分，通常ELISA試劑盒的有效使用期限即是根據(jù)酶結(jié)合物的穩(wěn)定性而定的。辣根過氧化物酶(HRP)：易于提取，價格相對低廉；性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱及有機(jī)溶劑的作用，與抗原或抗體偶聯(lián)后，活性很少受損失。堿性磷酸酶(ALP)：堿性磷酸酶用于ELISA必須注意的是含磷酸鹽的緩沖液對其酶活性的抑制作用F半乳糖甘酶影響試劑盒質(zhì)量的因素(5)色原底物：HRP最常用的色原底物有鄰苯二胺(OPD)和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。鄰苯二胺(OPD)：OPD被認(rèn)為是HRP最為敏感的色原底物之一，當(dāng)pH值降為1.0時，最大吸收波長為492nm，顯色加深，因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。OPD的缺點是其對機(jī)體具有致突變作用。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有最大消光系數(shù)。試劑盒中常為已配好的A、B兩種液態(tài)試劑，即一定濃度雙氧水溶液和TMB。它們在溶液中相對不穩(wěn)定，因此在使用ELISA試劑盒時，如底物A·或／和B出現(xiàn)顏色，或各取一滴混合后顯色，說明該試劑盒的底物溶液已變質(zhì)或已受污染，必須廢棄?！び绊懺噭┖匈|(zhì)量的因素2．試劑盒的方法學(xué)設(shè)計雙抗原夾心法測抗體(抗HIV、Tp)

洗板待測抗體底物溫育顯色酶標(biāo)抗原EE洗板YYYYYY固相抗原EYYYEEEYYYEEE影響試劑盒質(zhì)量的因素間接法測抗體（抗HCV、Tp)

洗板待測抗體底物溫育顯色EY酶標(biāo)抗體EYEY洗板YYYYYYYYYEYEYEYYYYEYEYEY固相抗原影響試劑盒質(zhì)量的因素雙抗體夾心法測抗原-兩步法固相抗體溫育待測抗原底物溫育顯色YYYEY酶標(biāo)抗體EYEYYYYYYYEYEYEYYYYEYEYEY影響試劑盒質(zhì)量的因素雙抗體夾心法測抗原-一步法待測抗原底物溫育顯色固相抗體YYYEY酶標(biāo)抗體EYEYYYYEYEYEY洗板YYYEYEYEYEYYYYEYEYEY影響試劑盒質(zhì)量的因素3．試劑盒的運輸和貯存ELISA試劑盒的效期一般為6個月，這是指在貯存溫度為2～8oC的情況下，但一個試劑盒從出廠至用戶手中，均要經(jīng)歷運輸(如送檢、檢定、發(fā)貨等)及運輸中的貯存，某一環(huán)節(jié)的不當(dāng)，均會影響試劑盒的臨床使用質(zhì)量。試劑盒的選用1．根據(jù)可能影響試劑盒質(zhì)量的因素，從以下幾個方面來判斷該試劑盒是否符合我們的要求效期固相材料的來源包被抗體或抗原的性質(zhì)(單抗、多抗或合成多肽或重組多肽)顯色底物(是TMB還是OPD)測定模式(一步法或二步法)試劑盒的選用2．同行對有關(guān)試劑盒的使用效果

個別的使用效果

在實際工作中，其它實驗室對某種試劑盒的實際使用效果，往往具有很強(qiáng)的說服力。

綜合的使用評價對一種試劑盒的綜合使用評價，是指多個實驗室對這種試盒實際應(yīng)用效果的綜合分析。ELISA試劑盒的質(zhì)檢1.包裝、儲存狀態(tài)內(nèi)外包裝、效期、試劑瓶是否漏液，真空包裝是否破損，試劑是否齊全等等2.采用血清盤(panel)質(zhì)檢血清盤由一定數(shù)量的陰、陽性樣本組成，可用來判斷試劑盒的靈敏度、特異性和符合率，如HBsAg、抗HCV和抗HIV等血清盤。ELISA試劑盒的質(zhì)檢

ELISA試劑盒的質(zhì)檢-HBsAgELISA試劑盒的質(zhì)檢-抗HCVELISA試劑盒的質(zhì)檢-TPELISA試劑盒的質(zhì)檢3.采用弱陽性定值質(zhì)控血清進(jìn)行質(zhì)檢對不同廠家或同一廠家不同批號試劑盒采用同一弱陽性定值質(zhì)控血清檢測，可比較出不同廠家或不同批號試劑盒的檢測靈敏度(測定下限)的差異，對判斷試劑盒的質(zhì)量及其穩(wěn)定性具有重要的參考價值。檢驗結(jié)果的正確與否，是試劑盒質(zhì)量、人員素質(zhì)、儀器設(shè)備狀態(tài)和室內(nèi)質(zhì)控措施等的綜合反應(yīng)，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都會導(dǎo)致檢測的失敗。目前試劑盒存在的問題

--抗HCV目前試追劑盒存訴在的問石題

-恩-抗HCV試劑的不爛足之處1.主要帳是在低危惡人群中仍事發(fā)現(xiàn)大量哈的不確定飲和假陽性揉結(jié)果，再這則仍有較謊長的“窗帽口期”。2.核心區(qū)驕抗原的貼減少程縫度把握細(xì)不好的辭話，有善可能會潤導(dǎo)致漏艙檢的發(fā)雹生。3.由于這懲些試劑附所使用娃HCV栗抗原只悼是病毒莫的部份航重組多天蛋白或除合成肽市抗原，凱加之，設(shè)固相對迅這些蛋輸白或多悼肽的吸斗附能力床的局限拘性，使凝得固相賀上能捕脾獲抗體筋的抗原吹決定基閑的數(shù)量貓有限，就從而影僅響測定獅的敏感餃性。目前試辰劑盒存稈在的問愧題

-便-抗HC賽V兩家試妻劑檢測續(xù)結(jié)果不貸一致1.不憤同試劑病廠家的ELIS續(xù)A試劑盒所辯用包被抗夕原的差異蘇：目前抗H違CV檢測豈ELIS范A試劑盒效均采用H謹(jǐn)CV的基柳因工程或窯合成多肽賢抗原（核豬心區(qū)、N焦S3、N究S4和N欣S5等）立包被固相鋼，以間接嗚法進(jìn)行測單定，由于閣上述HC籌V抗原的南組合、來倍源及用量蹦等方面的膚差異。2.所用岸包被抗原鴉成份相互糖之間抗原王決定簇的吼覆蓋，這燥種覆蓋將釋嚴(yán)重影響瞇ELIS況A測定的嗚敏感性。目前試制劑盒存禍在的問縫題

-泄-抗HCV對策--李--通常儀的做法是洽：初檢陰捎性的血袋濁再用與不就同廠家的溉國產(chǎn)試劑沸復(fù)檢，如掉仍為陰性正，血即為燒合格?；蚍空\初檢使用惕國產(chǎn)EL脈ISA試乘劑，復(fù)檢西采用進(jìn)口撇試劑。對策--叮--應(yīng)采撈取的辦法量：在血站車篩檢獻(xiàn)血孕員血時，摸初檢陰性商尤其是S條/CO值忌較高的血老液，最好酬使用不同染ELIS欣A試劑盒臉復(fù)檢，這據(jù)樣才能最則大程度的誰減少經(jīng)輸字血HCV雪感染的發(fā)鈴生。目前試梳劑盒存網(wǎng)在的問蔑題

-非-抗HCV抗HC化VE貍LIS揉A出現(xiàn)話假陽性讓的主要緞原因有往：1.類友風(fēng)濕因潛子（R堵F）的柔干擾2.高酬免疫球表蛋白血曲癥3.標(biāo)煉本中超倚氧化物喘歧化酶幼（SO逗D）的羅干擾4.用銀于固相壤包被的模HCV齊基因工導(dǎo)程抗原翅不純目前試說劑盒存馬在的問愁題

-百-抗HIV采用雙歷抗原夾汪心一步棒法檢測晉抗HI旱V-儉---壟“鉤狀填效應(yīng)”望所致的免假陰性蛛問題。1.原因控：HIV煤感染者中調(diào)有些抗體史滴度很高肺，采用可毅出現(xiàn)雙抗梅原夾心一它步法檢測窩，可出現(xiàn)哨類似雙抗熟體夾心一葡步法檢測腫抗原的“惑鉤狀效應(yīng)價”現(xiàn)象。2.措題施：在本血站篩宇檢獻(xiàn)血定員時，優(yōu)應(yīng)使用到二步法椅試劑盒跡進(jìn)行檢值測，或婦是對標(biāo)陽本進(jìn)行羞雙份同何時檢測馬，一份根原標(biāo)本移，一份祖1:1泰0或1姐:10舍0稀釋兵標(biāo)本，絹從而避哈免漏檢兄。目前試頭劑盒存范在的問性題

-鋪-抗HIVELI壟SA測滅定結(jié)果便的解釋1.一般蹄來說，一餐個感染H男IV的患四者，使用爺商品EL鴿ISA試鮮劑盒測定壟，結(jié)果應(yīng)店為陽性，韻因為在這飲些試劑盒港中所用的抽包被抗原陽主要為g橫ag編碼猜蛋白和病臉毒包膜蛋缺白，針對捐這些蛋白計的抗體在紅HIV感仔染的機(jī)體懲免疫應(yīng)答灘中出現(xiàn)最膠早，而E底LISA怕的測定敏比感性足以殊將其早期聯(lián)測出，因通此如果懷搞疑有可能炊的HIV籌感染，但烏ELIS朗A測定結(jié)偶果為陰性雕，則HI冶V感染的挺可能性很怪小。2.實餡驗操作價或試劑兆有問題貿(mào)或不能質(zhì)確定可閥能出現(xiàn)胖感染的西確切日餅期，如贊果HI咳V抗體全ELI癢SA測瘡定為陰燙性，就猛不必立患即重復(fù)蜻檢測。3.對露于處于芒陽性判保斷值（盆Cut含-of衛(wèi)f）邊偽緣即稍烘低于C鑄ut-抱off盜的樣本旺，難于繩判斷是失否為感雪染早期璃，或?qū)嵮噪H為非掌感染者棉的樣本滲，此時仆,可以昌再次取燭血測定稠和/或賀用另一工種EL扭ISA儲試劑盒肢檢測，寄從而明竭確測定宋結(jié)果。尼這種情啞況下，傍如果測灘定結(jié)果慘仍處于肺Cut巷-of都f邊緣犧，則建焦議數(shù)月潮后再次室測定,味如仍無損改變,卷則說明弦無HI嚼V感染呢.其它輛如免疫辯印跡,粥PCR虹測定H惹IV旅RNA胃也為此積種情況蔬下的H返IV感賞染驗證廁實驗.目前試健劑盒存澇在的問鉤題

-旁-梅毒螺旋心體抗體檢測方法1.檢馳測非特點異性抗微體--廚--使用類脂盡質(zhì)抗原的拔血清學(xué)試胡驗：RPR、荷TRUS暫T2.檢料測特異柴性抗體帆---刺-使用密親螺旋體墳抗原的購血清學(xué)糞試驗：結(jié)FTA廁-AB突S、T兩PHA劉、TP渠PA肺、EL戒ISA插、W必B目前試劑蘿盒存在的腸問題

-建-HBs綢Ag檢測靈刑敏度據(jù)文獻(xiàn)割報道，除到目前粘為止在塘獻(xiàn)血員阿中所發(fā)葉現(xiàn)的H溉BsA味g攜具帶者最崗低含量費為0.及2n貸g/m嶼l。病毒變異個別關(guān)鍵鼻的氨基酸們的替代變匪異，足以漠改變HB敗sAg梳的構(gòu)型，宰從而改變畫其抗原特按性不同亞型試劑盒脊臨床試竊用評價試劑盒芬臨床試既用評價試劑盒臨袖床試