CHIP-的難點和應用

染色質免疫沉淀（ChIP）技術的難點及應用序言隨著人類基因組測序工作的基本完成，功能基因組學的研究逐漸成為研究的熱點。而基因表達的調控又是功能基因組學的一個重要研究領域。研究某個蛋白因子的調控功能，可以通過對蛋白活性（激活或抑制其活性），蛋白數量（過表達Overexpression或基因缺陷型Knockout）,以及蛋白功能（功能缺陷型蛋白Dominant-negativemutation）的控制，影響下游基因的表達，而下游基因的變化又可以通過基因芯片（cDNAMicroarray），抑制消減雜交（SuppressionSubtractiveHybridization），差異顯示RT-PCR等方法進行研究[1]。然而這些方法都無法提供證據證明這些變化是受某個蛋白因子直接調節(jié)的，還是間接的其他變化導致的結果。所以，要想提供蛋白因子直接調控的證據，就要直接檢測蛋白質-DNA的相互作用。傳統(tǒng)的方法包括轉錄因子結合實驗（TranscriptionFactorAssay），電泳遷移率變動分析（electrophoreticmobilityshiftassay），DNaseI足印法（DNaseIfootprinting），酵母單雜交系統(tǒng)等。但這些方法都有一定的局限性，不能充分反映生理情況下DNA與蛋白相互作用的真實情況，而且很難捕捉到在染色質水平上基因表達調控的動態(tài)瞬時事件[2]。染色質免疫沉淀技術（ChromatinImmunoprecipitation，簡稱ChIP）是研究體內蛋白質與DNA相互作用的一種技術。它利用抗原抗體反應的特異性，可以真實地反映體內蛋白因子與基因組DNA結合的狀況。特別是近年來由于該技術不斷的發(fā)展和完善，其應用范圍已經從研究目的蛋白與已知靶序列間的相互作用，發(fā)展到研究目的蛋白與整個基因組的未知序列的相互作用；從研究一個目的蛋白與DNA的相互作用，發(fā)展到研究兩個蛋白與DNA共同結合的相互作用；從研究啟動子區(qū)域的組蛋白的修飾，發(fā)展到研究結合在DNA序列上的蛋白復合物。隨著對基因功能研究的不斷深入，這項技術正越來越多的被應用于科研的各個領域。目前已經有成熟的ChIP試劑盒出售，如Millipore公司提供的EZ-ChIP試劑盒，使得越來越多的研究者更容易地采用染色質沉淀技術在許多研究領域取得了成功。ChIP技術的原理染色質免疫沉淀技術的原理是：在生理狀態(tài)下把細胞內的DNA與蛋白質交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來。染色質免疫沉淀技術一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉淀，交聯(lián)反應的逆轉，DNA的純化，以及DNA的鑒定。因為ChIP實驗涉及的步驟多，結果的重復性較低，所以對ChIP實驗過程的每一步都應設計相應的對照，而且對結果的分析也需要有一定的經驗。對于剛剛開始使用ChIP技術的研究人員來說，使用成熟的商品化試劑盒和相關的技術服務會達到事半功倍的效果，比如Millipore公司的EZ-ChIP試劑盒就是專門為初學者設計的入門產品。下面我們就最基本的實驗步驟，實驗中的小技巧以及需要注意的問題簡單介紹一下。1.細胞固定甲醛能有效的使蛋白質-蛋白質，蛋白質-DNA，蛋白質-RNA交聯(lián)，形成生物復合體，防止細胞內組分的重新分布。甲醛的交聯(lián)反應是完全可逆的，便于在后續(xù)步驟中對DNA和蛋白質進行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時間通常為5分鐘到1個小時，具體時間根據實驗而定。值得注意的是，交聯(lián)時間如果過長，細胞染色質難以用超聲波破碎，影響ChIP結果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不完全，產生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應可被加入的甘氨酸終止。2.染色質斷裂交聯(lián)后的染色質可被超聲波或MicrococcalNuclease切成400~600bp的片段（用瓊脂糖凝膠電泳檢測），以便暴露目標蛋白，利于抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產生泡沫?？偝晻r間也不要太長，以免蛋白降解。MicrococcalNuclease可以將染色質切成一到幾個核小體，比超聲波處理的結果更精致，更均一（圖1）。另外，酶反應的條件比較溫和，對DNA和DNA-蛋白復合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質適用于新鮮的細胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時，經常采用沒經過甲醛固定的NativeChIP（N-ChIP）的研究方法。因為N-ChIP沒經過甲醛固定，超聲波處理會打斷組蛋白和DNA的結合，所以只能選擇酶處理染色質的方法。對于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。Millipore公司有商品化的MicrococcalNuclease處理的ChIP試劑盒（EZ-Enzyme）提供。染色質免疫沉淀的DNA適用于多種分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要驗證的，可采用狹縫雜交（Slotblot）的方法，把靶序列特異性探針與染色質免疫沉淀的DNA雜交，來驗證目的蛋白與DNA靶序列的特異性結合。還可以根據靶序列設計引物，用半定量PCR的方法進行測定，或采用Real-timePCR方法進行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的（high-throughput），可采用Southern雜交。但因為免疫沉淀的DNA量較少，所以在研究時通常要用PCR方法擴增DNA探針，再進行整個基因組掃描。還可以把沉淀的DNA克隆到載體中，進行測序，尋找該序列附近的開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)新的基因調節(jié)序列。目前，隨著人類基因組測序工作的基本完成，研究目的蛋白和整個基因組的相互作用逐漸成為研究的熱點。由于基因組中的信息量非常大，上述常規(guī)方法通常無法滿足科研的需要。近年來發(fā)展起來的ChIP-chip技術將基因組DNA芯片（chip）技術與染色質免疫沉淀技術（ChIP）相結合，為研究目的蛋白與整個基因組相互作用提供了可能。ChIP-chip技術通過標記染色質免疫沉淀富集的DNA片段，和另一個被標記不同探針的對照組樣品一起，與DNA芯片雜交，再利用各種生物信息學方法對收集到的信號進行分析，具體的實驗步驟請參考Dr.RichardYoung在NatureProtocols上的文章[3]。ChIP-chip技術已經被廣泛應用于研究轉錄因子在整個基因組中的信號網絡[4,5,6]，染色質修飾機制在基因組中的調控[7,8]，DNA的復制，修復以及修飾[9,10]，基因的轉錄與核運輸[11,12,13]等諸多方面。染色質免疫沉淀技術還可用于分析兩種蛋白共同結合的DNA序列，即ChIPreChIP方法。ChIPreChIP是在第一次ChIP的基礎上不解交聯(lián)，而繼續(xù)進行另一個目的蛋白的免疫沉淀，從而得到與兩種目的蛋白都結合的DNA序列。值得注意的是，因為通過兩次免疫沉淀富集的DNA量比較少，所以在分析時通常要把多次免疫沉淀的DNA濃縮后再進行操作。隨著染色質免疫沉淀技術受到廣泛的關注，運用該技術發(fā)表的文章也逐漸增多，大家越來越多的開始關注如何改進ChIP的方法。Millipore最新推出的MagnaChIP試劑盒，利用磁珠分離DNA-蛋白-抗體復合物，提高了ChIP的效率，簡化了操作的過程，縮短了實驗的時間，還為同時進行多個目的蛋白的研究提供了可能，是經常使用ChIP技術的研究人