第一組蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的測(cè)定

第一組蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的測(cè)定第1頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三NMR

(nuclearmagneticresonance)核磁共振第2頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三前言簡介約15,000種蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)已被解出，80%是用X-ray解出，20%用NMR解出NMR解出三維結(jié)構(gòu)時(shí)不需要長單晶(singlecrystal)，只要溶在水溶液當(dāng)中即可，比較符合生物巨分子的生理狀態(tài)。第3頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三NMR產(chǎn)生訊號(hào)的原理

1.C、N、H、S等atoms的同位素label→l不等於0→始可產(chǎn)生NMR訊號(hào)〈補(bǔ)充〉每個(gè)元素中的核子(nucleus)，其磁自旋量子數(shù)

(magneticspinquantumnumber)以I

來代表。

若I≠0

，此核子在磁場(chǎng)中，會(huì)產(chǎn)生NMR訊號(hào)

若I=0，此核子在磁場(chǎng)中，無法產(chǎn)生NMR訊號(hào)。

質(zhì)量數(shù)和質(zhì)子數(shù)均為偶數(shù)的原子核，l=0質(zhì)量數(shù)為奇數(shù)的原子核，l=半整數(shù)

質(zhì)量數(shù)為偶數(shù)，質(zhì)子數(shù)為奇數(shù)的原子核，l=整數(shù)

第4頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三核磁共振儀的射頻器(transmitter)打了一個(gè)脈衝(pulse)，將此淨(jìng)磁化量偏移z軸，此偏移的磁化量就沿著磁場(chǎng)方向(z軸)做進(jìn)動(dòng)(precession)。造成此磁化量形成陀螺的軌跡，如下頁圖所示。此磁化量的軌跡，會(huì)引導(dǎo)一個(gè)振盪電流而被記錄下來。第5頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三2.從NMR的peakarea和高度比可知特定原子的數(shù)量和原子鍵結(jié)的環(huán)境。第6頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三NMR的光譜分析一維：H太多→訊號(hào)複雜→難以分析第7頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三二維：NOE效應(yīng)→可得知原子間的距離第8頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三三維：NOE效應(yīng)+TOCSY技術(shù)+NOESY技術(shù)

→

旋性、凡得瓦半徑、鍵角

→輸入computerrun出可能的三度結(jié)構(gòu)第9頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三〈補(bǔ)充〉NOE效應(yīng)

(NuclearOverhouserEffect)

NMR之所以能解出蛋白質(zhì)分子在水溶液的三維結(jié)構(gòu)，主要的就是要靠NOE效應(yīng)。NOE＝(I′

－I0)/I0I′為質(zhì)子對(duì)被照射時(shí)的intensityI0

為質(zhì)子對(duì)未被照射時(shí)的intensity如果NOE愈強(qiáng)，表示二質(zhì)子間距離愈短。NOE的大小與質(zhì)子對(duì)之間距(γ)的6次方成反比：NOE∝1/γ6第10頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三NMR的研究領(lǐng)域一、蛋白質(zhì)與分子之結(jié)合(Interaction)

利用核磁共振技術(shù)我們可輕易地藉由測(cè)量化學(xué)位移擾動(dòng)(chemicalshiftperturbation)的方式找出protein與ligand作用的殘基，亦可進(jìn)一步解出整個(gè)complex的結(jié)構(gòu)?；瘜W(xué)位移的擾動(dòng)主要是因?yàn)閜rotein與ligand結(jié)合後某些殘基會(huì)和ligand接觸或作用，而使得化學(xué)環(huán)境改變，藉由測(cè)量各個(gè)殘基化學(xué)位移的變化情形，便能找出ligand的結(jié)合位置(活性位置)。第11頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三

二、蛋白質(zhì)分子之折疊(ProteinFolding)

自然界中所存在的折疊構(gòu)形約只有1,000-5,000種。且有許多蛋白質(zhì)屬於同一個(gè)family，具有高度的sequencehomology。定出這1,000-5,000種蛋白質(zhì)的折疊構(gòu)形並研究這些構(gòu)形所具有的生化活性，便能提供其他屬於同family的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)與功能上的資訊。第12頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)缺比較

X-ray繞射技術(shù)

§快速且較不受分子量的限制

§但是並不是每一種蛋白質(zhì)都能得到良好的結(jié)晶，(蛋白質(zhì)結(jié)晶的取得仍是現(xiàn)今結(jié)晶技術(shù)的一大挑戰(zhàn))核磁共振

§找尋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)較耗費(fèi)人力及時(shí)間

§圖譜分析的工作是既複雜又費(fèi)時(shí)

第13頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三X-RayCrystallography第14頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三原理:所謂X-Ray繞射結(jié)晶法即是利用X-Ray射向蛋白質(zhì)晶體使X-ray產(chǎn)生繞射，經(jīng)由繞射使照相底片曝光而產(chǎn)生一投影圖形，再將此繞射圖案作分析，作出電子密度圖，經(jīng)過一連串的計(jì)算之後，即可判定出蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)!

Why要使用X-Ray?

我們採用X光來決定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，最大的理由，即是因?yàn)閄光的波長10-12-10-8m恰好近似於蛋白質(zhì)晶體的晶格大小，因而可以產(chǎn)生繞射，且由於X光無法聚焦，因此我們必須使用底片曝光法來分析繞射所得的結(jié)果。第15頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三X光依形成的方式不同，分成兩種：

(1)Whiteradiation:

以經(jīng)高壓加速之電子撞擊陽極靶標(biāo)，高速電子受到靶標(biāo)原子的阻擋，急遽停止下來，其部分動(dòng)能即以X光的形式釋出來。以急遽停止電子所產(chǎn)生之X光與原子之特性無關(guān)，而是以連續(xù)性不同波長同時(shí)出現(xiàn)，其中最短波長取決於撞擊電子的最高能量。如此產(chǎn)生的光譜，亦稱為白光光譜或連續(xù)光譜(ContinuousX-rayspectrum)。

(2)Monochromaticradiation:

高速電子在撞到原子時(shí)，很容易將能量傳遞給原子中的電子，而使原子離子化。當(dāng)原子內(nèi)層軌域之電子被激發(fā)後，其空出之位置很快會(huì)被外層電子的躍入填滿，在此電子躍遷過程中，由於不同軌域間的能階差，X光會(huì)隨著放出；此種過程所產(chǎn)生的X光與原子中電子軌域之能階有關(guān)，因此其波長與原子種類有關(guān)，稱之為特性輻射，所形成之光譜則稱為特性光譜(characteristicspectrum)。第16頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質(zhì)結(jié)晶製備!!X光繞射結(jié)晶法當(dāng)中很重要的一個(gè)條件就是sample的製備，若是不可結(jié)晶，則鐵定不能進(jìn)行X光繞射。蛋白質(zhì)要結(jié)晶，首先必須要先大量製備我們所要結(jié)晶的蛋白質(zhì)，因此會(huì)裡用載體將記載蛋白質(zhì)序列的核酸輸入到生產(chǎn)蛋白質(zhì)的菌體中，如此便可大量製造出純度高的蛋白質(zhì)，而後氣相擴(kuò)散法將此蛋白質(zhì)結(jié)晶出來。結(jié)晶方式:用氣相擴(kuò)散法結(jié)晶(VaporDiffusionMethod)，也就是將含有高濃度的蛋白質(zhì)溶液加入適當(dāng)?shù)娜軇?，慢慢降低蛋白質(zhì)的溶解度，使其接近自發(fā)性的沉澱狀態(tài)時(shí)，蛋白質(zhì)分子將在整齊的堆疊下形成晶體。第17頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三NMR與X-Ray的比較X-ray的缺點(diǎn)主要是結(jié)晶難結(jié)，也並非所有蛋白質(zhì)都容易結(jié)晶。一旦結(jié)晶了，又要擔(dān)心他跟平時(shí)會(huì)否有異，譬如某些水溶性的蛋白質(zhì)，原本水分子能協(xié)助固定有功能的構(gòu)型，將其結(jié)晶後，離開了水的環(huán)境，失去固定而變成另一種沒有功能的構(gòu)型。相對(duì)的，NMR的原理不同，並不需要整齊的晶體排列，而是看原子核的磁力矩。NMR不需要結(jié)晶，也就避開了許多X-ray繞射的缺點(diǎn)；NMR可以看到生物分子在正常生理狀態(tài)下的構(gòu)型，可以觀察到連續(xù)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，比較不會(huì)受到水分子的干擾。有一點(diǎn)值得注意的是，NMR用低能量的無線電波，而X-ray繞射要用高能量的X-ray，能量差距相當(dāng)?shù)拇?。雖然NMR看似比X-ray繞射有更多的好處，但NMR有一個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)：只能觀察20000原子量以內(nèi)的分子。因?yàn)镹MR是觀察一個(gè)一個(gè)的原子，X-ray繞射則是觀察一個(gè)一個(gè)的晶格；NMR的視野被侷限在原子大小，但是X-ray可大可小，他能觀察金屬原子的晶體，也能觀察生物巨分子的晶體。我們不能直接判斷NMR跟X-ray繞射孰優(yōu)孰劣，兩者是互補(bǔ)的關(guān)係。第18頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三水的影響蛋白質(zhì)結(jié)晶中常含40~60%的水，其液態(tài)的成分會(huì)使晶體易碎，且容易使蛋白質(zhì)分子在排列上有不規(guī)則的情形出現(xiàn)，造成繞射數(shù)據(jù)的混亂。但是，若是完全除水的晶體，蛋白質(zhì)的狀態(tài)又與自然環(huán)境下不同，因此水是個(gè)很令人頭痛的問題。第19頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CircularDichrosim(CD)圓二色光譜第20頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三PolarizerEvectors平面偏振光振動(dòng)方向保持不變振幅發(fā)生周期性變化平面偏振光第21頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三

兩束相互垂直而相位相差1/4的波長的平面偏振光可以加和成一束圓偏振光平面偏振光疊加成圓偏振光第22頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三振幅保持不變，而方向周期變化，電場(chǎng)向量繞傳播方向螺旋前進(jìn)圓偏振光(circularpolarizedlight)第23頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三朝光源看，電場(chǎng)向量方向按順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的，稱為右圓偏振光；電場(chǎng)向量方向按逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的，稱為左圓偏振光。第24頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三圓二色性(circulardichrosim)光學(xué)活性分子對(duì)左、右圓偏振光的吸收也不同，使左、右圓偏振光透過後變成橢圓偏振光，這種現(xiàn)象稱為圓二色性。第25頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CD的操作方法左圓、右圓的平面偏振光照射有光學(xué)異構(gòu)的分子，會(huì)造成不一樣的吸光度。而不同的結(jié)構(gòu)有獨(dú)特的測(cè)出來的吸收?qǐng)D形，因此可以經(jīng)由比對(duì)得知立體結(jié)構(gòu)第26頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三CD對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究方法:將待測(cè)蛋白質(zhì)溶於適當(dāng)溶劑中，用特定波長的UV測(cè)其吸收度，與已知的二級(jí)結(jié)構(gòu)的吸收度圖比對(duì)，即可查出未知之結(jié)構(gòu)建立資料庫:選取基本的二級(jí)結(jié)構(gòu)，將各波長不同的CD吸收值代入程式可得蛋白質(zhì)中各種二級(jí)結(jié)構(gòu)之百分比第27頁，共30頁，2023年，2月20日，星期三第28頁，共30頁，2023年，