降鈣素介紹的學習教案

降鈣素介紹的學習教案第1頁/共19頁主要內容：降鈣素簡介降鈣素的結構與生物活性降鈣素在體內的作用降鈣素的適用癥降鈣素的藥理機制降鈣素的獲取方法降鈣素的現狀及發(fā)展參考文獻第2頁/共19頁降鈣素的簡介降鈣素(calcitonin,CT)是32個氨基酸組成的多肽，它是由脊推動物的后鰓體和哺乳動物的甲狀腺C細胞分泌的激素，在骨和腎都有相應的受體，具有調節(jié)鈣、磷代謝作用，有多種臨床應用。不同來源的降鈣素氨基酸序列不同，一般有2～19個氨基酸殘基的差別，并且有8個氨基酸殘基是不變的(位置1、4、5、6、7、9、28和32)，但對人沒有種屬特異性，都有活性。第3頁/共19頁降鈣素的結構與生物活性在降鈣素分子中氨基酸殘基與生物活性有直接關系：N端1,7位上兩個半胱氨酸之間的二硫鍵和C端的脯氨酰胺,以及兩端在空間上并列的構象是其體內生物活性所必須的。中間的氨基酸殘基(10～27)控制著生物活力的大小和作用時間的長短。降鈣素的結構修飾表明:去C端的脯氨酸胺、切去一段C端、打開或切掉二硫鍵或者氧化人降鈣素第8位的甲硫氨酸都將使活力降低或喪失。氧化豬、牛、羊降鈣素第25位的甲硫氨酸和用碳碳鍵代替鰻降鈣素的二硫鍵生物活力將不發(fā)生改變。用較小側鏈氨基酸替代修飾鯉降鈣素(8位ValGly,16位LeuAla)將產生更高生物活力的類似物。第4頁/共19頁降鈣素的結構優(yōu)化上世紀八十年代的科研發(fā)現：1985年以前的文獻,主要報道的是設計能提高8→22間形成α-helix能力的新型降鈣素,以期通過提高α-helix形成的能力來創(chuàng)造出更高活性的分子。缺陷：CT在體內發(fā)揮生物學作用還必需與受體結合,這就存在一個相互誘導契合的過程。因此,分子形成α-helix能力太強,必然會使分子剛性增加,影響與受體結合,導致活性下降?，F階段的科研發(fā)現：降鈣素的活性的提高取決于多個方面，不應該強調某一點，導致整體的活性下降。主要包括以下幾個方面，(1)構象的柔順性(2)形成α-螺旋的能力(3)遠程作用(4)肽鏈的親水性/疏水性第5頁/共19頁降鈣素的結構優(yōu)化從疏水性親水性方面入手發(fā)現：PEG可與蛋白質相容，用其對多肽類藥物進行化學修飾已經成為醫(yī)學和生物工程領域的熱門課題，現已得到了廣泛的研究和應用。因此有許多研究者嘗試用PEG修飾降鈣素，以期獲得一種高效、低毒的降鈣素藥物。實驗進展：Youn等將分子量為2000的PEG分別與降鈣素多肽上1位的半胱氨酸、11位的賴氨酸、18位的賴氨酸相偶聯，發(fā)現PEG偶聯在18位的賴氨酸上時，降鈣素的生物活性最高。PEG：即為聚乙二醇，通過不同的制備工藝可生產不同相對分子質量的聚合物。第6頁/共19頁人類與鮭魚降鈣素的比較氨基酸序列的比較：sCT:Cys?Ser?Asn?Leu?Ser?Thr?Cys?Val?Leu?Gly?Lys?Leu?Ser?Gln?Glu?Leu?His?Lys?Leu?Gln?Thr?Tyr?Pro?Arg?Thr?Asn?Thr?Gly?Ser?Gly?Thr?Pro-NH2hCT:Cys?Gly?Asn?Leu?Ser?Thr?Cys?Met?Leu?Gly?Thr?Tyr?Thr?Gln?Asp?Phe?Asn?Lys?Phe?His?Thr?Phe?Pro?Gln?Thr?Ala?Ile?Gly?Val?Gly?Ala?Pro-NH2結構域的比較:(1)N-端1→7由二硫鍵形成的環(huán)狀結構(2)8→22的兩性α-螺旋結構(3)23→32的C-末端無規(guī)則親水結構根據實驗測得：sCT的活性遠遠大于hCT第7頁/共19頁降鈣素在體內的作用甲狀旁腺細胞PTH促進骨骼釋放腸道吸收腎臟重吸收血鈣升高甲狀腺C細胞降鈣素抑制骨骼釋放腸道吸收腎臟重吸收血鈣降低注：這里吸收和釋放的為鈣離子所以降鈣素在人體的主要功能是調節(jié)血鈣和血磷濃度，和甲狀腺素共同維持機體的血鈣血磷平衡。第8頁/共19頁降鈣素的適用癥①畸形性骨炎：本品用于治療中度至重度癥狀明顯的畸形性骨炎。Paget病具有骨痛和骨畸形、心衰及耳聾等癥狀的病人應考慮用本品治療。②高血鈣癥：多種原因可引起高鈣血癥，如維生素D中毒、腫瘤、甲狀腺和甲狀旁腺功能亢進等。③絕經期骨質疏松④老年人骨質疏松第9頁/共19頁降鈣素的藥理機制鎮(zhèn)痛作用機制：與其他抑制骨吸收的藥物不同的是，降鈣素可以減輕骨痛。此作用最早于1974年被報道于治療佩吉特氏病，1年后通過動物模型證明降鈣素確實具有鎮(zhèn)痛作用。此后的臨床研究發(fā)現，降鈣素對多種疼痛有效，包括反射性交感神經營養(yǎng)不良綜合征、黏連性關節(jié)囊炎、強直性脊柱炎、風濕性關節(jié)炎、脊椎壓縮骨折、幻肢痛等。降鈣素的鎮(zhèn)痛作用機制主要是臨床發(fā)現，具體機制不明，處于猜想和假設階段。主流的機制猜想：?降鈣素能抑制前列腺素E2的合成，而前列腺素有痛覺感受器增敏的效果。因此減輕了痛覺的感受能力。?降鈣素通過激活內源性阿片系統(tǒng)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，因為降鈣素受體（CTRs）結構與阿片受體類似，且降鈣素能夠提高血漿β-內啡肽水平。第10頁/共19頁降鈣素的藥理機制實驗驗證：?降鈣素在腦內的結合位點位于痛覺感受區(qū)，腦室內給予sCT可以提高家兔的痛閾值，此作用不能被阿片受體拮抗藥納洛酮所對抗，因此有研究者設想降鈣素也可能是通過直接激動中樞神經系統(tǒng)內的CTRs而發(fā)揮作用。?有報道稱在大鼠腦橋髓質部發(fā)現了sCT的特異性結合位點，進一步證實了這一設想。治療高血鈣機制：PPT的第7頁詳細的介紹了降鈣素（CT）和甲狀旁腺激素（PTH）是如何共同維持人體的血鈣血磷平衡的但是當平衡被打破，血鈣濃度超標，人體的正常滲透壓大大升高危及生命時就需要介入外源的降鈣素將血鈣濃度降下來。引發(fā)人體血鈣升高的原因：維生素D中毒、腫瘤、甲狀腺和甲狀旁腺功能亢進等。鮭降鈣素用于高鈣血癥危象的早期治療，此時需要迅速降低血清鈣的濃度。緩解癥狀后再具體分析病因，找出血鈣升高原因。第11頁/共19頁降鈣素的藥理機制治療骨質疏松的藥理機制：近年來的研究表明，降鈣素抑制骨吸收的作用與破骨細胞（OC）的特殊結構偽足小體有關。OC通過富含肌動蛋白的偽足小體來黏附骨髓基質。降鈣素則可以使偽足小體解聚，促使OC收縮，降低其運動性，最終使其與骨脫離。注：骨吸收，指在較低的應力水平下，骨組織的體積和密度逐漸發(fā)生下降的生理行為。第12頁/共19頁降鈣素的獲取方法提取法:以牛、豬的甲狀腺或鮭魚、鰻魚的鰓為原料經組織搗碎丙酮沉淀脫脂,除去雜蛋白質CMC柱純化、收集含降鈣素溶液凍干或用2mol/L的氯化鈉鹽析制得降鈣素粉末缺陷：由于天然原料含量極微,限制了該法制取降鈣素。日本山之內公司的降鈣素就是由豬甲狀腺中提取的,規(guī)格有每瓶40或160單位注射液。第13頁/共19頁降鈣素的獲取方法化學合成法：因為降鈣素為32肽，且有一個二級結構。因此化學合成法步驟多、得率低、純度差、價格昂貴(例如國產密蓋息注射劑市場價為250IU370元,按活性最高的突變鮭魚降鈣素的生物活性8400IU·mg-1計算,相當于12000元/mg)，這嚴重限制了它的使用和推廣，在此略過?；蚬こ谭?由于降鈣素是32肽的小分子多肽激素,在E.Coli中表達極易被降解,因此主要采用融合法。（如果目的基因生產的蛋白質為降鈣素和另一種蛋白質的融合蛋白，并且有相應的酶可以將二者分開，那么就可以避免降鈣素的降解，此即為融合法）融合法引申出的問題就是C-末端32位脯氨酰胺的轉化問題。這也是基因工程技術生產降鈣素的關鍵和難點。第14頁/共19頁基因工程法生產降鈣素用pGEX質粒作為表達載體,將降鈣素分子與GST(谷胱甘肽轉移酶)蛋白融合表達融合蛋白用G-Sepharose-4B柱親和層析純化BrCN裂解融合蛋白α-AE酶使C-末端產生脯氨酰胺HPLC純化得到純化的降鈣素（收率達到85%以上）美國PharmaGenetics公司應用基因工程法生產鮭魚降鈣素的方法第15頁/共19頁降鈣素的現狀歐盟限制降鈣素產品的使用:2012年7月19日，歐洲藥品管理局（EMA）完成了一項對含降鈣素藥品的利益和風險的評估，結論為：有證據顯示，長期使用此類藥品可導致癌癥風險小幅增高。人用藥品管理委員會（CHMP）建議，應將此類藥品僅應用于短期治療Paget病、因突然制動導致的急性骨缺失和癌癥引起的高鈣血癥。該委員會的另一結論為，在骨質疏松癥治療中，含降鈣素藥品的獲益未能超出其帶來的風險，因此不應再將此類產品用于骨質疏松癥的治療。近年來,人們對CTR（降鈣素受體）的結構、功能及其作用機制已經進行了研究,并對編碼CTR的cDNA進行了克隆、測序和表達。更深入的研究還在進行中,如基因疫苗,將CTR基因在載體上表達后,注入動物體內,在啟動子的作用下在動物機體內表達,使CTR作為一種抗原在體內調節(jié)降鈣素的分泌和作用。此外,可考慮用中藥或新藥來刺激甲狀腺內的濾泡旁細胞分泌降鈣素,可替代目前降鈣素的補償療法。第16頁/共19頁此類藥的發(fā)展前景中國正在進入一個老年化社會,老年人易患骨質疏松癥,該疾病也是一個世界性公眾健康問題。據統(tǒng)計美國每年要花費約100億美元用于治療骨質疏松癥,每年有130萬人患骨質疏松癥引起的骨折,其中的髖部骨折是一種毀滅性的并發(fā)癥,約5%～20%病人骨折后1年內死亡,50%以上的生存者致殘。目前關于此類疾病的研究越來越多，相信在不久的將來科學家們能夠發(fā)明一種新藥更好的治療骨質疏松，又沒有太多的不良反應，為人類健康做貢獻。第17頁/共19頁參考文獻[1]侯笑然,張慶,李國坤,邱志霞,陳西敬.降鈣素的研究進展[J].中國藥房,2011,(17):1617-1619.[2]鎬英杰,高坤,王義生,李杰.降鈣素對破骨細胞增殖和凋亡的調節(jié)作用[J].中國組織工程研究與臨床康復,2008,(28):5410-5413.[3]張玉彬,吳梧桐,吳文俊.降鈣素的研究進展[J].中國藥學雜志,1996,(08):3-6.[4]張玉彬,吳滔,吳梧桐,等.新型降鈣素的基因合成與克隆表達[J].藥物生物技術,1999,6(3):129-134.[5]何順漪.利用IMPACT-T