第二章之微生物菌種選育

第二章之微生物菌種選育第1頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三Contents菌種的來源1發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育2菌種退化和菌種保藏3微生物菌種的擴大培養(yǎng)4第2頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)菌種的來源擔子菌細菌酵母霉菌放線菌菌種一、工業(yè)發(fā)酵常見微生物第3頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三細菌醋酸桿菌假單胞菌乳酸菌AddYourTitle大腸桿菌枯草芽孢桿菌棒桿菌、短桿菌第4頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三酵母菌釀酒酵母異常漢遜氏酵母異常變種假絲酵母屬AddYourTitle畢赤氏酵母屬漢遜氏酵母屬第5頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三霉菌曲霉屬青霉屬根霉屬毛霉屬第6頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三二、工業(yè)微生物來源source1source2source3向菌種保藏機構(gòu)索取從大自然中分離篩選從發(fā)酵制品中分離第7頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三三、微生物菌種的選擇性分離微生物樣品的采集微生物樣品的富集培養(yǎng)目的菌種的分離目的菌的篩選1234第8頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三微生物樣品的采集第9頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三微生物樣品的富集培養(yǎng)1控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分2控制培養(yǎng)條件3抑制不需要的菌類第10頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三目的菌種的分離平板稀釋法平板劃線法第11頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三平板劃線法b.

連續(xù)劃線分離法

分區(qū)劃線分離法第12頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三1.稀釋平皿分離法平板稀釋法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀釋第13頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三b.傾注平皿分離法a.涂布平皿分離法（2）倒平板第14頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素的菌株

羧甲基纖維素鈉作培養(yǎng)物抗生素篩選檢定菌培養(yǎng)，加上發(fā)酵液目的菌的篩選第15頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三影印平板法篩選目的菌第16頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三四、重要工業(yè)微生物菌種的分離篩選菌株的一些重要指標：（1）菌的營養(yǎng)特征（2）菌的生長溫度（3）菌對所采用的設備和生產(chǎn)過程的適應性（4）菌的穩(wěn)定性（5）菌的產(chǎn)物得率和產(chǎn)物在培養(yǎng)液中的濃度（6）容易從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物。生產(chǎn)性能第17頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三抗生素產(chǎn)生菌的篩選Text抗生素產(chǎn)生菌的篩選抑菌圈法稀釋法生物自顯影法擴散法第18頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三抑菌圈法第19頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三生長因子產(chǎn)生菌的篩選產(chǎn)生藥理活性化合物菌株的篩選多糖產(chǎn)生菌的篩選第20頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三自然選育誘變育種雜交育種基因工程育種原生質(zhì)體融合第二節(jié)發(fā)酵高產(chǎn)菌種的選育第21頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三菌種改良物理化學生物遺傳基因第22頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三一、自然選育自然選育在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)突變，選育出優(yōu)良菌種的過程。第23頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三誘變育種誘變育種是利用物理或化學誘變劑處理均勻分散的微生物細胞群，促進其突變率大幅度提高，然后采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株，以供生產(chǎn)實踐或科學研究用。

第24頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三誘變育種的原理誘變育種的理論基礎是基因突變生物誘變劑化學誘變劑物理誘變劑紫外線快中子NTGNM噬菌體轉(zhuǎn)座子第25頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三超凈工作臺小型X射線衍射儀Co60射線機第26頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三誘變育種的一般步驟保誘變篩選放大罐試驗，中試考查大型投產(chǎn)第27頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇制備菌懸液誘變處理突變菌株的篩選第28頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三(一)出發(fā)菌株的選擇1．自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果。2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。第29頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三4．出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。5．要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。第30頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三

(二)處理菌懸液的制備這一步驟的關(guān)鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。帶玻璃珠的三角瓶內(nèi),加無菌水第31頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三(三)誘變處理根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實際，設計誘變處理方案。第32頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三(四)突變菌株的篩選篩選分初篩和復篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異。

第33頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三1)營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。與營養(yǎng)缺陷型對應的是野生型。第34頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三與篩選營養(yǎng)缺陷型有關(guān)的三類培養(yǎng)基：①基本培養(yǎng)基（MM，minimalmedium）——能滿足某一菌種的野生型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。②補充培養(yǎng)基（SM，supplementalmedium）——在基本培養(yǎng)基中有針對性地補加某一種或幾種營養(yǎng)成分，以滿足相應的營養(yǎng)缺陷型菌株生長需要（其他營養(yǎng)缺陷型仍不能生長）的培養(yǎng)基。③完全培養(yǎng)基（CM，completemedium）——可滿足該菌各種營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。第35頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜第36頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三一、誘變方法物理誘變化學誘變第37頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。第38頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三

三、檢出缺陷型原理：利用不同菌株在固體基本培養(yǎng)基（MM）和完全培養(yǎng)基（CM）上，生長情況完全不同的特點。缺陷型菌株在CM上生長良好，而在MM上則不生長，而野生型都能生長。具體方法：影印法、點種法、夾層法

第39頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三

(一)影印法

此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應有一定間隔。第40頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三

(二)點種法也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法結(jié)果明確，但工作量大。第41頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三

(三)夾層法先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。第42頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三四、營養(yǎng)缺陷型的鑒定驗證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長譜測定。第43頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三（1）氨基酸、維生素、核酸堿基三大類營養(yǎng)缺陷的鑒定abcabcabca-氨基酸混合液b-維生素混合液c-核酸水解液第44頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三（2）單一氨基酸營養(yǎng)缺陷的確定將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。—個平皿測一個菌。第45頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三第46頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三1組氨酸蘇氨酸谷氨酸天冬氨酸亮氨酸甘氨酸2賴氨酸蘇氨酸蛋氨酸異亮氨酸纈氨酸丙氨酸3苯丙氨酸谷氨酸蛋氨酸酪氨酸色氨酸絲氨酸4

胱氨酸天冬氨酸異亮氨酸酪氨酸精氨酸脯氨酸5亮氨酸纈氨酸色氨酸精氨酸6甘氨酸丙氨酸絲氨酸脯氨酸第47頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三生長圈位置營養(yǎng)要求生長圈位置營養(yǎng)要求1組氨酸2、3蛋氨酸2賴氨酸2、4異亮氨酸3苯丙氨酸2、5纈氨酸4胱氨酸2、6丙氨酸1、2蘇氨酸3、4酪氨酸1、3谷氨酸3、5色氨酸1、4天冬氨酸3、6絲氨酸1、5亮氨酸4、5精氨酸1、6甘氨酸4、6脯氨酸第48頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三原理：抗反饋阻遏和抗反饋抑制突變株都是由于代謝失調(diào)所造成的，在細胞中已經(jīng)有大量最終代謝產(chǎn)物時仍然繼續(xù)不斷地合成這一產(chǎn)物。

方法：選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株結(jié)構(gòu)類似物是指一些和微生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相類似的物質(zhì)，因而能夠引起反饋，但是它們不能參與生物合成。目的：主要用于末端產(chǎn)物的積累2）抗反饋阻遏和抗反饋抑制突變株的篩選第49頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三在培養(yǎng)基中添加末端產(chǎn)物類似物后，未突變的細胞將由于代謝途徑受阻而不能獲得生物合成所需的該種末端產(chǎn)物，從而導致細胞死亡。那些對類似物不敏感的突變體，則由于原來受反饋控制的酶的結(jié)構(gòu)，或是酶的合成系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)生了改變，它們不再受抑制或阻遏的影響，在類似物充斥的情況下照常能合成該種末端產(chǎn)物。例如，用類似物D-精氨酸選出的谷氨酸棒桿菌的抗反饋突變株可使L-精氨酸的產(chǎn)量得到提高。第50頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三3）抗性突變菌株的篩選抗生素抗性突變株在抗生素產(chǎn)生菌選育中，通過篩選抗生素抗性突變可提高抗生素產(chǎn)量?？股乜剐酝蛔冎瓿芴岣呖股氐漠a(chǎn)量外，還能提高其它代謝產(chǎn)物的量。條件抗性突變因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為"野生型"菌株的特性和突變型菌株特性的突變稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。溫度敏感突變常用于提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量致死營養(yǎng)缺陷第51頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三抗性突變菌株的篩選方法一次性篩選法一次性篩選法就是指在對出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株。噬菌體抗性菌株耐高溫菌株第52頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三階梯性篩選法

梯度平板法

第53頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程第54頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三三、雜交育種標記標記親和力親和力A+B+C-D-A-B-C+D+A+B+C+D+第55頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三接合兩株E.coli的接合電鏡照片第56頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三DNA的轉(zhuǎn)化第57頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三轉(zhuǎn)導第58頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三準性生殖第59頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三四、原生質(zhì)體融合通過人工方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生重組子的過程。原生質(zhì)體的重組頻率已大于1/10，而誘變育種一般僅為百萬分之一。第60頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三第61頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三五、基因工程育種第62頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)菌種的退化和菌種的保藏菌種退化1微生物菌種保藏2第63頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三一、菌種退化是指在較長時期傳代保藏后，菌株的一個或多個生理性狀和形態(tài)特征逐漸減退或消失的現(xiàn)象。第64頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三（一）引起菌種退化的原因基因突變連續(xù)傳代其他因素第65頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三（二）菌種的復壯使衰退的菌種恢復原來優(yōu)良性狀。狹義的復壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個體，以達到恢復該菌原有典型性狀的措施；廣義的復壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識的經(jīng)常、進行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。第66頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三菌種的復壯措施①純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細胞挑取法等）。

②通過寄主體內(nèi)生長進行復壯（如Bacillusthuringiensis的復壯）；

③淘汰已衰退的個體（采用比較激烈的理化條件進行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體）。

④采用有效的菌種保藏方法。第67頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三1）合理的育種；

2）控制傳代次數(shù)（一般在DNA的復制過程中，堿基的錯配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8~10-9，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的數(shù)）；

3）選擇合適的培養(yǎng)條件；

4）采用不同類型的細胞進行傳代（對絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進行接種）；

5）采用有效的菌種保藏方法。（三）防止菌種衰退的方法第68頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三1.目的：

①存活，不丟失，不污染

②防止優(yōu)良性狀喪失

③隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種

2.原理：選用優(yōu)良的純種，（最好是休眠體，如分生孢子、芽胞等），創(chuàng)造降低微生物代謝活動強度，生長繁殖受抑制，難以發(fā)生突變的環(huán)境條件。（其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺營養(yǎng)以及添加保護劑等）。二、菌種保藏第69頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三菌連續(xù)在培養(yǎng)基上（內(nèi)）移種種生活態(tài)傳代培養(yǎng)保藏法連續(xù)在活宿主上（內(nèi)）移種保固體斜面藏濕法半固體瓊脂柱方休眠態(tài)液體介質(zhì)（蒸餾水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管內(nèi)吸附在合適的載體上3.菌種保藏的方法第70頁，共75頁，2023年，2月20日，星