大小型層析柱的裝填實踐介紹中文

大小型層析柱的裝填實踐介紹中文演示文稿目前一頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點優(yōu)選大小型層析柱的裝填實踐介紹中文目前二頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點TOYOPEARL樹脂填料的裝填裝填前的準備工作小顆粒的去除緩沖液平衡勻漿準備裝填步驟/層析柱類型層析柱的操作柱子的平衡與柱效評價保存內(nèi)容提要PeakBiotech目前三頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點裝填的一般原則☆TOYOPEARL的裝填壓力最好在0.5-5bar的范圍內(nèi)☆裝填流速至少比實際操作流速高50%☆不要使用會產(chǎn)生剪切力的裝置（如：磁力攪拌器、

齒輪泵）-這些裝置會磨碎樹脂填料并產(chǎn)生小顆?！頣OYOPEARL是一種剛性強的樹脂填料，裝填時務(wù)必區(qū)別于一般的軟式瓊脂糖凝膠

Superformance/G?tecTOYOPEARL樹脂填料的裝填目前四頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點基本步驟去除小顆粒裝填緩沖液平衡勻漿準備裝柱TOYOPEARL出貨時為懸浮液狀態(tài)（含20%乙醇）TOYOPEARL樹脂填料的裝填目前五頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點裝柱前務(wù)必進行小顆粒去除的操作!小顆粒的存在會阻塞篩板或燒結(jié)板，并最終會導致整個柱子的壓降增大小顆粒的去除采取懸浮靜置移注法重復(fù)這一步驟不少于3次借助顯微鏡可檢查小顆粒的存在小顆粒的去除目前六頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點TOYOPEARL粒徑CoarseC級規(guī)格:100μmMediumM級規(guī)格:65μmFineF級規(guī)格:45μmSuperfineS級規(guī)格:35μm水中靜置時間15-30Min.30-45Min.45-60Min.60-90Min.AmiconModuline-120cmID顯微鏡微觀顯示–Toyopearl650MTOYOPEARL的靜置時間目前七頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點在去除小顆粒時的最后一次步驟中可加入裝填緩沖液進行填料的平衡最好根據(jù)實際生產(chǎn)中所使用的緩沖液選取合適的裝填緩沖溶液一般來講，分離純化工藝中將使用到的最高離子強度的流動相是裝填緩沖液的首選這一操作可以將填料裝得最為緊密，并且可以防止死體積的發(fā)生或膠體內(nèi)溝槽的出現(xiàn)。

裝填緩沖液的平衡目前八頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點TOYOPEARL-典型的裝填緩沖溶液目前九頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點利用量筒測量靜置膠體體積或使用水泵抽濾漿液至濕濾餅后計算裝填所需要的填料體積通過添加裝填緩沖液調(diào)節(jié)漿液濃度:流動式裝填柱~40-70%(v/v)自動裝填柱20-60%(v/v)

最終裝填好的柱床體積是要小于裝填前膠體靜置體積或抽干的濕濾餅的體積SlurrypreparationinthecolumnSlurrypreparationinaseparatetankSettlingresinAmiconModuline-120cmID勻漿準備目前十頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點ToyopearlHW-40,HW-50,HW-55HW-65andHW-75FEther-650,Phenyl-650Butyl-650,DEAE-650Super-Q-650,CM-650SP-650andallAffinityQAE-550CandSP-550C使用約1.1倍柱體積的靜置膠使用約1.2倍柱體積的靜置膠使用約倍柱體積的靜置膠對于給定的柱子，裝柱所需的靜置膠體積目前十一頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點恒流速裝填法恒壓裝填法輔助的重力沉降裝填法

不同裝填方法的特點裝填方法 恒流速

恒壓

重力沉降裝填速度

快 快 慢流速范圍 可增大至較高 可增大至較高 只能慢操作重復(fù)性 很好

很好 好

泵 恒速 恒壓

蠕動泵壓力計 需要 需要 不需要主要裝填方法目前十二頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點方法簡介:將柱底篩板用裝填緩沖液潤濕（趕走氣泡）任何時候，均需確保漿液在注入層析柱前進行過勻漿操作勻漿液倒入后，立刻將分配器置于儲槽內(nèi)漿液表面分配器與溶液漿液間不應(yīng)有氣泡存在階段性調(diào)整裝填流速至目標流速，以產(chǎn)生一個實時的、沒有太大振動的栓塞流在最初的壓實操作基礎(chǔ)上，為進一步壓實柱床，至少泵入5-10倍柱體積的裝填緩沖液調(diào)整分配器至膠體表面重復(fù)后兩個步驟，直至柱床被徹底壓實。最后將分配器移至距離柱床2-5mm處（最后一次）。不要擔心使用分配器的同時進行柱床的壓實操作！MilliporeQuikScaleFlowPackedColumns(Millipore-QuikScale+Moduline,GEHealthcare-BPG,G?tec-Superformance,BioRad-Geltec,etc.)恒流速裝填方法目前十三頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點模式填料類型柱尺寸[cmIDxL]填料等級裝填流速[cm/h]操作流速

[cm/h]SECHW-40HW-50HW-55HW-65HW-752,2x602,2x602,2x602,2x602,2x60S(30um)F(45um)C(75um)S(30um)F(45um)S(30um)F(45um)S(30um)F(45um)F(45um)30–4060–80120–16025–3550–7025–3550–7020–7540–15040–15010–2525–5050–10010–2025–3510–2025–3510–1515–3015–30IECDEAE-650,SuperQ-650CM-650,SP-650SP-550,QAE-550MegaCapIISP-5502,2x202,2x202,2x20S(35um)M(65um)C(100um)C(100um)EC(100-300um)400–600800–1000800–1200700–1000800–120045–6580–13080–60080–24080–500HICEther-650,Phenyl-650,Butyl-650

PPG-600,Butyl-600SuperButy-550,Hexyl-5502,2x202,2x202,2x20S(35um)M(65um)C(100um)M(65um)C(100um)400–600800–1000800–1200800–1000800–120045–6580–13080–50080–13080–500AFCAF-Amino-650,AF-Carboxy-650AF-Formyl-650,AF-Epoxy-650AF-Tresyl-650,AF-Chelate-650,AF-BlueHC-650,AF-Heparin-HC-650AF-Red-6502,2x10M(65um)800–100030–130實驗室規(guī)模最優(yōu)化的裝填及柱操作流速目前十四頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點柱尺寸(I.D.xL)2.2cmx60cm9cmx30cm25cmx30cm填料類型HW-55SQAE-550CDEAE-650M目標流速(ml/min)23002000增加量(ml/min)0.550500

保持時間(min)0.522

恒流速裝填法中流速的增加量舉例：恒流速裝填方法目前十五頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點G?tec/Superformance20cmIDColumn氣泡會由于切換閥、管路連接處、

活塞運動、未脫氣緩沖液而引起........恒流速裝填方法-擾動（由入口處篩板下氣泡而引起的）目前十六頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點裝填運行管路清洗卸料HorizontalFlow-“SelfPacker”-presetcolumnvolume(Pall/Euroflow-ResoluteTM,Millipore-IsoPakTM,GEHealthcare-Chromaflow,EasternRiver)優(yōu)點：易于裝填弱點：填料用量較大,卸料可能較難,有剪切力發(fā)生,

卸料會導致大量的漿液體積Resolute恒壓裝填方法目前十七頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點RadialFlow-“SelfPacker”-presetcolumnvolume

(Proxcys-CRIO)Lowspacerequirements–only0,5~1m2;even600literBVismountedonwheelsLargeinletsurfacearea–cotrolled&gentleproductapplication(“NaturalDistribution”).Thinfritkeepstheresintogether–itisnotusedasflowdistributor–>abarrierofonly~60um–negligibleinfluenceonpressuregenerationIdenticalpathlengthforallsubstancesA-ECRIO601S5literBVCRIO-ColonneRadialeInOxidable恒壓裝填方法目前十八頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點DynamicAxialCompression(Novasep,PeakBiotech,Technikrom,GEHealthcare)UnpackingPneumatic/HydraulicSlurrytransfer優(yōu)點：裝填操作簡單，非?？烊秉c：卸料會導致大量的漿液體積(whilecolumnisassembled)；不易操作g(whiledisassemblingthecolumn),卸料緩慢PeakBiotech/DanProcess-DAC恒壓或恒流速裝填方法目前十九頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點不要使用沒有進行正確柱效評價的層析柱!!!SEC、RPC及HIC型層析柱的柱效與裝填質(zhì)量密切相關(guān)的。只有IEC和AFC型層析柱，在沒有高塔板數(shù)時也能正常工作。盡管如此，對稱性因子還是相當重要的。層析柱操作目前二十頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點使用5-10倍柱體積的低離子強度緩沖液進行柱子的平衡使用低分子量、無保留的化合物進行柱效的測定（如：丙酮、鹽）進樣體積為柱體積的0.25-1%將測定而得的塔板數(shù)、不對稱性因子與廠家提供的最小值相比較如果未達到最小塔板數(shù)等期望值，必須重新進行柱子的裝填！可供選擇的方法:使用高離子強度的裝填緩沖液，使用低鹽溶液或水進樣，會產(chǎn)生一個負的電導信號/倒峰（不需要平衡、節(jié)省時間等）柱效評價目前二十一頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點N=platespercolumnVe=elutionvolume[cmorml]W1/2=widthofthepeakathalfpeakheight[cmorml]Symmetry:Distanceb/a=peakwidthat10%peakheight[cmorml]Injectionab1/10hhhVe1/2hW1/2N=5.54(Ve/W1/2)2結(jié)果與下列因素有關(guān):

評價操作（因人而異）

進樣的可重復(fù)性（硬件影響）流速

進樣樣品的分子尺寸柱效與不對稱性因子的計算目前二十二頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點樣品：丙酮Pall–Resolute400TOYOPEARL填料裝填柱的最小柱效值目前二十三頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點理想的峰形(Gau?)與非理想的峰形Gau?

前沿/前伸峰

拖尾峰

柱效評價–峰形目前二十四頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點前沿峰的處理提高漿液濃度降低裝填壓力縮短靜置時間(在柱中)拖尾峰的處理與前沿峰的處理方法相反低柱效的處理去除小顆粒重新平衡膠體改變樣品/樣品緩沖液檢查檢測器/泵Pall-Resolute柱效評價–常見問題及處理目前二十五頁\總數(shù)二十八頁\編于十八點II流動式裝填中出現(xiàn)溝槽/管路柱床發(fā)生塌陷IBPG20cm