4600.3飼料中違禁物質(zhì)檢測(cè) 第3部分：大環(huán)內(nèi)酯類

Q/LB.□XXXXX-XXXXDB37/T4600.3—2023前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB37/T4600《飼料中違禁物質(zhì)檢測(cè)》的第3部分。DB37/T4600已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第3部分：大環(huán)內(nèi)酯類。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實(shí)施。本文件由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。引言近年來，作為飼料添加劑的大環(huán)內(nèi)酯類藥物成為我國乃至世界范圍內(nèi)需求量和銷售速度增長(zhǎng)最快的抗生素之一。但長(zhǎng)期使用這類抗生素不僅在動(dòng)物體內(nèi)造成殘留，還會(huì)隨糞便排出體外進(jìn)而污染環(huán)境，導(dǎo)致微生物菌群的失調(diào)和革蘭氏陽性菌耐藥性的增加，對(duì)動(dòng)物及人類健康產(chǎn)生危害。目前還沒有針對(duì)飼料中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測(cè)的方法標(biāo)準(zhǔn)。因此，研究飼料中紅霉素、羅紅霉素、竹桃霉素、泰樂菌素、替米考星、交沙霉素留限量及其檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于控制動(dòng)物源性食品藥物殘留，保證食品質(zhì)量安全和消直接費(fèi)者食用安全有著重要的意義。飼料中違禁物質(zhì)檢測(cè)第3部分：大環(huán)內(nèi)酯類范圍本文件規(guī)定了飼料中羅紅霉素、替米考星、泰樂菌素、交沙毒素、竹桃毒素、紅霉素6種大環(huán)內(nèi)酯類藥物測(cè)定的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料中羅紅霉素、替米考星、泰樂菌素、交沙毒素、竹桃毒素、紅霉素6種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的測(cè)定。本方法檢出限為5?μg/kg，定量限為10?μg/kg。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。原理用乙腈提取樣品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物，固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。試劑或材料除非另有說明，在分析中所用試劑均為分析純和符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。乙腈（CH3CN，75-05-8）：色譜純。甲酸（HCOOH，64-18-6）：色譜純。甲醇（CH3OH，67-56-1）：色譜純。0.1?mol/L氫氧化鈉溶液。稱取4.0?g氫氧化鈉，并用水稀釋至1?L，搖勻。磷酸鹽緩沖溶液：0.1?mol/L。稱取6.0?g磷酸氫二鈉溶解于450?mL水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=8，用水定容至500?mL，搖勻。0.1?%甲酸溶液。準(zhǔn)確吸取甲酸（5.2）1?mL加水至1?000?mL，搖勻。0.1?%甲酸-乙腈溶液。0.1?%甲酸溶液（5.6）+乙腈（5.1）=50+50，搖勻。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1.0?mg/mL。準(zhǔn)確稱取羅紅霉素（CAS編號(hào)：80214-83-1，純度≥95?%）、替米考星（CAS編號(hào)：108050-54-0，純度≥95?%）、泰樂菌素（CAS編號(hào)：1401-69-0，純度≥95?%）、交沙霉素（CAS編號(hào)：16846-24-5，純度≥95?%）、竹桃霉素（CAS編號(hào)：7060-74-4，純度≥95?%）、紅霉素（CAS編號(hào)：114-07-8，純度≥95?%）標(biāo)準(zhǔn)品各約10?mg（精確至0.01?mg），分別置于10?mL容量瓶中，用乙腈溶解定容。于-18?℃以下保存，有效期為3個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5.8），用乙腈配制成濃度為10?μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。4?℃保存，有效期為1個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)工作液。用空白樣品提取液分別配成濃度為1?ng/mL，5?ng/mL，10?ng/mL，50?ng/mL，100?ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。聚苯乙烯二乙烯基苯吡咯烷酮填料固相萃取柱或者相當(dāng)者：60?mg/3?mL。儀器設(shè)備高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器，配有電噴霧離子源（ESI）。分析天平：感量分別為0.01?mg和0.01?g。離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于8?000?r/min。固相萃取裝置。氮吹儀。渦旋振蕩器。微孔濾膜：0.22?μm，有機(jī)系。樣品按照GB/T20195的規(guī)定，選取有代表性的樣品，粉碎使之完全通過0.42?mm孔徑的分析篩，裝入磨口瓶，密封保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)步驟提取平行做兩份試驗(yàn)，準(zhǔn)確稱取2?g試樣（精確至0.01?g）置于50?mL離心管中，準(zhǔn)確加入10mL乙腈（5.1），渦旋，超聲提取10?min，于8?000?r/min離心10?min。準(zhǔn)確移取上清液2?mL，加入10?mL磷酸鹽緩沖溶液（5.5），渦旋混勻，備用。凈化固相萃取柱（5.11）預(yù)先依次用3?mL甲醇（5.3），3?mL水，3?mL磷酸鹽緩沖液（5.5）活化。移取提取液（8.1）過固相萃取柱，用3?mL水淋洗，棄去全部流出液。用3?mL甲醇（5.3）洗脫，收集洗脫液。將洗脫液50?℃氮吹濃縮至近干，準(zhǔn)確加入1.0?mL甲酸水-乙腈溶液（5.7）溶解，渦旋混勻，用0.22?μm濾膜過濾后，待測(cè)。測(cè)定液相色譜參考條件色譜柱：C18柱，2.1?mm×50?mm，1.7?μm或相當(dāng)者。柱溫：35?℃。進(jìn)樣量：1.0?μL。流動(dòng)相、流速及梯度洗脫條件見表1。流動(dòng)相、流速及梯度洗脫參考條件時(shí)間min流速mL/min甲酸溶液%乙腈%00.380204.00.320805.00.320805.10.380206.00.38020質(zhì)譜參考條件電離模式：電噴霧正離子。毛細(xì)管電壓：3.0?kV。離子源溫度：150?℃。脫溶劑溫度：350?℃。脫溶劑氮?dú)饬魉伲?00?L/h。檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。定性、定量離子參考條件見表2。定性、定量離子對(duì)藥物名稱定量離子對(duì)m/z定性離子對(duì)m/z錐孔電壓V碰撞能量eV替米考星869.5＞174.4869.5＞174.4869.5＞156.635355040泰樂菌素916.5＞174.2916.5＞174.2916.5＞772.720201515紅霉素734.6＞158.5734.6＞158.5734.6＞576.518181317羅紅霉素837.6＞679.6837.6＞679.6837.6＞158.420201422交沙霉素828.8＞174.3828.8＞174.3828.8＞229.330301414竹桃霉素688.6＞158.4688.6＞158.4688.6＞544.625251319定性測(cè)定在相同試驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)物質(zhì)保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間的偏差不超過標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間的±2.5?%，且樣品中各組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。定性離子確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差（%）相對(duì)離子豐度＞50＞20～50＞10～20≤10允許的最大偏差±20±25±30±50定量測(cè)定在儀器最佳條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)工作液與試樣交替進(jìn)樣，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正，外標(biāo)法定量。樣品溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)，當(dāng)樣品的上機(jī)液濃度超過線性范圍時(shí)，需根據(jù)測(cè)定濃度，稀釋后進(jìn)行重新測(cè)定。上述色譜和質(zhì)譜條件下，大環(huán)內(nèi)酯類標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見附錄A。數(shù)據(jù)處理用數(shù)據(jù)處理軟件中的外標(biāo)法，或繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照公式（1）計(jì)算樣品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留量： X=C×V×fm (AUTONUM)式中：X——試樣中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的殘留量，單位為微克每千克（μg/kg）C——由標(biāo)準(zhǔn)曲線而得的樣液中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的濃度，單位為微克每升（μg/L）；V——樣品定容體積，單位為毫升（mL）；m——樣品質(zhì)量，單位為克（g）；f——稀釋倍數(shù)。測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，計(jì)算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。精密度在重復(fù)性條件下，兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對(duì)差值不大于該算術(shù)平均值的15?%。

（資料性）

大環(huán)內(nèi)酯類藥物特征離子質(zhì)量色譜圖大環(huán)內(nèi)酯類藥物基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖見圖A.1。紅霉素