引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析

引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析引物設(shè)計(jì)基本原則引物長(zhǎng)度（primerlength）產(chǎn)物長(zhǎng)度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)G+C含量（composition）引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin）閱讀框引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析1.引物的長(zhǎng)度

一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，即Taq酶(Taq酶是從水生棲熱菌ThermusAquaticus（Taq）中分離出的具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶。對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。與一般酶不同,用Taq酶擴(kuò)增DNA時(shí)常使片段3'端凸出一個(gè)A,應(yīng)注意)的最適溫度引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析2.產(chǎn)物的長(zhǎng)度

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100~600堿基對(duì).引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析3.Tm值

引物的Tm值一般控制在55-60度,盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過(guò)2度.如果引物中的G+C含量相對(duì)偏低,則可以使引物長(zhǎng)度稍長(zhǎng),而保證一定的退火溫度.Tm=2(A+T)+4(C+G)引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析4.引物的GC含量

有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析5.堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析6.引物自身

引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析7.引物之間

兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析8.引物的3′端引物的延伸是從3′端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析9.引物的5′端

引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。

引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析10.密碼子的簡(jiǎn)并如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析11.引物的特異性引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析任務(wù)設(shè)計(jì)DJ-1蛋白表達(dá)引物引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析Plasmid1:引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析Plasmid2引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析第一步：檢索DJ-1mRNA基本序列LOCUSNM_0571431097bpmRNAlinearROD

1gtgccgagcacagttactggaaggcttaaccaaagttttgatgcctgggaaccgcgcagg61aaaaacacgcggaacgtgcttcacagtggcggctaactgctctcgttcgctgtgcagagc121cgtctggcagggttgacctcctaaagggatattccatctttattaatcattagtagtgtg181gtcagagacttagcaccattggtctcccccaacctggtccagacatttcagcagtttatc241ggaacagcaacaacagcaacaaaaccttcaaaatttacaagtctttaagaaatagaaatg301gcatccaaaagagctctggtcatcctagccaaaggagcagaggagatggagacagtgatt361cctgtggacatcatgcggcgagctgggattaaagtcaccgttgcaggcttggctgggaag421gaccccgtgcagtgtagccgtgatgtagtgatttgtccggataccagtctggaagaagca481aaaacacagggaccatacgatgtggttgttcttccaggaggaaatctgggtgcacagaac541ttatctgagtcggctttggtgaaggagatcctcaaggagcaggagaacaggaagggcctc601atagctgccatctgtgcgggtcctacggccctgctggctcacgaagtaggctttggatgc661aaggttacatcgcacccattggctaaggacaaaatgatgaacggcagtcactacagctac721tcagagagccgtgtggagaaggacggcctcatcctcaccagccgtgggcctgggaccagc781ttcgagtttgcgctggccattgtggaggcactcagtggcaaggacatggctaaccaagtg841aaggccccgcttgttctcaaagactagagagcccaagccctggaccctggacccccaggc901tgagcaggcattggaagcccactagtgtgtccacagcccagtgaacctggcattggaagc961ccactagtgtgtccacagcccagtgaacctcaggaactaacgtgtgaagtagcccgctgc1021tcaggaatctcgccctggctctgtactattctgagccttgctagtagaataaacagttcc1081ccaagctcctgacggct

引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析第二步：利用PrimerPremier5設(shè)計(jì)引物Primer1:5’ATGGCATCCAAAAGAG…………..Primer2:5’TCTAGTCTTTGAGAACA…….引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析PrimerPremier5.0是由加拿大的Premier公司開(kāi)發(fā)的專(zhuān)業(yè)用于PCR或測(cè)序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評(píng)估的軟件，其主要界面分為序列編輯窗口（Genetank），引物設(shè)計(jì)窗口（PrimerDesign），酶切分析窗口（RestrictionSites）和紋基分析窗口（Motif），這里我們主要介紹其引物設(shè)計(jì)功能。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析打開(kāi)程序首先進(jìn)入的是序列編輯參看引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析這是根據(jù)模板序列尋找引物的界面，在該界面中可以設(shè)定所要搜索的引物的類(lèi)型，包括PCR引物，測(cè)序引物和雜交探針以及引物所在的鏈；另外也能設(shè)定搜索引物的范圍，以及最終PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和引物的長(zhǎng)度等。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析AutomaticSearch自動(dòng)搜索引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析在結(jié)果窗口中給出了程序給該對(duì)引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和長(zhǎng)度以及產(chǎn)物的長(zhǎng)度。通過(guò)直接點(diǎn)擊各對(duì)引物在相應(yīng)引物搜尋界面中相應(yīng)的顯示引物的各種信息。包括其各種參數(shù)和各種可能存在的不利結(jié)構(gòu)。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析PRIMERPREMIER能即時(shí)分析引物二級(jí)結(jié)構(gòu)。在左下的兩排按鈕可以顯示發(fā)現(xiàn)了何種二級(jí)結(jié)構(gòu)，也顯示二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能數(shù)值G單位kcal/mol。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析EditPrimer引物編輯窗口可以用來(lái)設(shè)計(jì)用于定點(diǎn)突變的引物或分析一條已有引物序列?？梢允褂肅TRL-XCTRL-C和CTRL-V快捷鍵來(lái)實(shí)施剪切拷貝和粘貼刪除當(dāng)前引物序列,并從剪貼板上粘貼是分析一條已有引物的好方法。進(jìn)行粘貼時(shí)Paste粘貼窗口會(huì)激活，用以將引物序列轉(zhuǎn)化為反向互補(bǔ)或反向互補(bǔ)形式，也可以手工鍵入引物序列。一旦引物被編輯發(fā)點(diǎn)擊Analyze按鈕即可分析編輯后的引物。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析引物長(zhǎng)度引物的長(zhǎng)度控制著引物的特異性和在PCR反應(yīng)中的退火溫度.對(duì)越多數(shù)實(shí)驗(yàn)適宜引物長(zhǎng)度為18到24個(gè)堿基,等于或少于15堿基的短引物有時(shí)用于簡(jiǎn)單的基因作圖或特殊的文庫(kù)構(gòu)建libraryprotocol,28到35堿基的長(zhǎng)引物對(duì)于從一系列高度相關(guān)的分子中擴(kuò)增序列和特殊樣本的克隆能起到重要作用。長(zhǎng)PCR引物能給擴(kuò)增帶來(lái)更好的特異性,長(zhǎng)引物也允許通過(guò)降低退火溫度來(lái)能提高反應(yīng)的靈敏度,不過(guò)長(zhǎng)引物通常更易于形成包括發(fā)卡結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等二級(jí)結(jié)構(gòu)。理論上在合適的融鏈溫度范圍內(nèi)最短的引物能在特異性和高效性間獲得較好的平衡。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析為設(shè)計(jì)一條高效引物有幾個(gè)參數(shù)必須考慮PRIMERPREMIER搜索所考慮的參數(shù)依次如下Tm融鏈溫度：PRIMERPREMIER根據(jù)相鄰二堿基對(duì)作用理論nearestneighbortheory來(lái)計(jì)算融鏈溫度。PCR反應(yīng)的合適Tm范圍為56到63°C。GC%GC含量：對(duì)于PCR反應(yīng)來(lái)說(shuō)GC含量在50%左右比較合適而對(duì)于測(cè)序引物和雜交探針來(lái)說(shuō)GC含量至少應(yīng)為50%。Degeneracy多義性：當(dāng)設(shè)計(jì)多義引物時(shí)應(yīng)盡量減少引物多義性這樣會(huì)帶來(lái)更好的特異性應(yīng)盡量避免3末端的多義性因?yàn)檫@里即使一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物延伸。3’EndStability3末端穩(wěn)定性：引物穩(wěn)定性影響它的錯(cuò)配效率。一條理想的引物應(yīng)該有一個(gè)穩(wěn)定性較強(qiáng)的5末端和相對(duì)穩(wěn)定性較弱的3末端，如果引物3穩(wěn)定性強(qiáng)有可能在即使5末端不配對(duì)的情況下造成錯(cuò)配形成非特異性擴(kuò)secondarybands。而3末端穩(wěn)定性低的引物較好的原因是在引物發(fā)生錯(cuò)配時(shí)由于3末端不太穩(wěn)定引物結(jié)合不穩(wěn)定而難以延伸。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析GCClampGC鉗：引物與目的位點(diǎn)的有效結(jié)合需要有穩(wěn)定的5末端，這一段有較強(qiáng)穩(wěn)定性的5末端稱(chēng)為GC鉗。它保證引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析SecondaryStructures二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)是引物設(shè)計(jì)中必須考慮的一個(gè)重要因素二級(jí)結(jié)構(gòu)能顯著影響反應(yīng)中能與模板正確結(jié)合的引物數(shù)量。發(fā)卡結(jié)構(gòu)的存在能限制引物與目的位點(diǎn)的結(jié)合能力，從而降低擴(kuò)增效率。形成發(fā)卡環(huán)的引物則不能在PCR擴(kuò)增中發(fā)揮作用。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析Hairpin發(fā)卡結(jié)構(gòu)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是由于引物自身的互補(bǔ)堿基分子內(nèi)配對(duì)造成,引物折疊形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是分子內(nèi)的反應(yīng),僅僅需要三個(gè)連續(xù)堿基配對(duì).發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可以用自由能衡量,自由能大小取決于堿基配對(duì)釋放的能量以及折疊DNA形成發(fā)卡環(huán)所需要的能量,如果自由能值大于0則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,從而不會(huì)干擾反應(yīng).如果自由能值小于0則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)。按下按鈕All可以顯示其具體結(jié)構(gòu)。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析Dimer二聚體引物之間的配對(duì)區(qū)域能形成引物二聚體，它是相同或不同的兩條引物之間形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。它造成引物二聚體擴(kuò)增并減少目的擴(kuò)增，產(chǎn)物二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向引物之間形成，如果配對(duì)區(qū)域在3末端問(wèn)題會(huì)更為嚴(yán)重，3末端配對(duì)很容易引起引物二聚體擴(kuò)增使用DimerReport功能可以預(yù)測(cè)二聚體的形成。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過(guò)4.5，二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析FalsePriming錯(cuò)配如果引物可以結(jié)合除目的位點(diǎn)外的其他區(qū)域擴(kuò)增效率將明顯降低，目的產(chǎn)物帶將減少或出現(xiàn)涂布（smear），PRIMERPREMIER會(huì)檢查每一條引物是否會(huì)與整個(gè)序列的其他位點(diǎn)形成局部的錯(cuò)配，3末端連續(xù)幾個(gè)堿基配對(duì)形成錯(cuò)配的傾向要高于引物上游區(qū)域同樣數(shù)量的堿基配對(duì)。可以分別設(shè)定確認(rèn)為錯(cuò)配的3末端或引物全長(zhǎng)形成連續(xù)堿基配對(duì)的數(shù)量。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析PairRating匹配度評(píng)分匹配度低的引物對(duì)常常不太有效，是因?yàn)樵谕瑯油嘶饻囟认拢琓m低的引物決定擴(kuò)增的特異性，而Tm高的引物更易于形成非特異性結(jié)合而造成錯(cuò)誤的起始。PRIMERPREMIER會(huì)計(jì)算每一對(duì)引物的匹配度100分為滿分并按照分?jǐn)?shù)按降序排列計(jì)。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析PairRating

FormulaforDeterminingSinglePrimerRating

Rating=100-(△G(Dimer)1.7+△G(Hairpin))1.4+△G(FalsePriming)1.5)

FormulaforDeterminingPrimerPairRatingRating=Averageofsenseandanti-senseprimerrating-((Tmdifferencebetweenprimers)*1.7)-(DGCrossDimer)*1.3))引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析第三步：酶切位點(diǎn)Primer1:5’ATGGCATCCAAAAGAG（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’TCTAGTCTTTGAGAACA

（GC:57%,Tm：66）EcoRI:GAATTC

Primer1:5’GAATTCATGGCATCCAAAAGAG

Primer2:5’GGTACCTCTAGTCTTTGAGAACA

KpnI：

GGTACC

引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析第四步保護(hù)堿基Primer1:5’CCGGAATTCATGGCATCCAAAAGAGPrimer2:5’

CGG

GGTACC

TCTAGTCTTTGAGAACA引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析第五步blast驗(yàn)證引物進(jìn)入網(wǎng)頁(yè)：http:///BLAST/引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析點(diǎn)擊BasicBLAST中的nucleotideblast選項(xiàng)引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析在EnterQuerySequence欄中輸入引物序列：注：文獻(xiàn)報(bào)道ABCG2的引物為5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’簡(jiǎn)便的做法是同時(shí)輸入上下游引物。輸入上下游引物系列都從5’—3’。輸入上游引物后，加上≥20個(gè)字母n，再輸入下游引物，如下圖：引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析在ChooseSearchSet欄中：

Database根據(jù)預(yù)操作基因的種屬定了，本引物可選Humangenomic+transcript或Others(nretc.)。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析在ProgramSelection中：選擇Somewhatsimilarsequences(blastn)項(xiàng)，如下圖：引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析在此界面最下面關(guān)鍵要點(diǎn)擊Algorithmparameters參數(shù)設(shè)置，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析在GeneralParameters中：Expectthresshold期望閾值須改為1