實(shí)驗(yàn)二植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)二植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的測(cè)定第1頁(yè)/共15頁(yè)NO3-和NH4+是能被植物利用的最主要的氮源。在一般田間條件下，NO3-

是植物吸收的主要形式。第2頁(yè)/共15頁(yè)硝酸鹽的還原硝酸鹽硝酸還原酶亞硝酸鹽氨亞硝酸還原酶第3頁(yè)/共15頁(yè)

硝酸還原酶是一種誘導(dǎo)酶，在植物體內(nèi)本來(lái)不含有，但在特定外來(lái)物質(zhì)的如NO3-誘導(dǎo)下可以生成硝酸還原酶。第4頁(yè)/共15頁(yè)硝酸還原酶（NR）是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽：

NO3-+NADH+H+NO2-+NAD++H2O

產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對(duì)-氨基苯磺酸（或?qū)Π被交酋０罚┘唉?萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。NR【實(shí)驗(yàn)原理】第5頁(yè)/共15頁(yè)

生成的紅色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法測(cè)定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般以單位時(shí)間內(nèi)每克鮮重含氮量表示，即以μg/g/h為單位。NR的測(cè)定可分為活體法和離體法。活體法步驟簡(jiǎn)單，適合快速、多組測(cè)定。離體法復(fù)雜，但重復(fù)性較好。第6頁(yè)/共15頁(yè)第7頁(yè)/共15頁(yè)小麥的新鮮葉片（誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組）【實(shí)驗(yàn)材料】第8頁(yè)/共15頁(yè)⑴冷凍離心機(jī)；⑵分光光度計(jì)；⑶天平(0.01g)；⑷冰箱；⑸恒溫水浴；⑹研缽；⑺剪刀；⑻離心管；⑼移液管(5、2、1mL)；⑽洗耳球；⑾試管架；(12)膠頭滴管?！緦?shí)驗(yàn)器材】第9頁(yè)/共15頁(yè)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取7支潔凈烘干的15ml刻度試管按下表順序加入試劑，配成0-0.20μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)亞硝態(tài)氮溶液。搖勻后在25℃下保溫30min，然后在540nm下比色測(cè)定。以亞硝態(tài)氮濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），吸光值為縱坐標(biāo)（r）建立回歸方程。【實(shí)驗(yàn)步驟】第10頁(yè)/共15頁(yè)管號(hào)1234567試劑取量mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液00.10.20.40.60.81.0蒸餾水1.00.90.80.60.40.201%磺胺22222220.2%萘基乙烯胺2222222每管亞硝態(tài)氮濃度μg/mL00.020.040.080.120.160.20第11頁(yè)/共15頁(yè)酶的提取稱取0.5-1g鮮樣（誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組分別進(jìn)行），剪碎置冰箱冰凍30min，取出置研缽中，冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移入離心管中，洗研缽2-3次，將液體轉(zhuǎn)入離心管中，共用提取液6mL，4℃8000rpm離心15min，上清液即為粗酶提取液。酶反應(yīng)取4個(gè)10mL離心管，按照下表所列進(jìn)行操作，混勻，25℃保溫30min。終止反應(yīng)和比色測(cè)定

30min后立即加入lmL磺胺溶液終止酶反應(yīng)，再加lmL萘基乙烯胺溶液，顯色30min后于4000rpm離心5min，取上清液在540nm下比色測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出反應(yīng)液中亞硝態(tài)氮濃度（μg/mL）。

反應(yīng)底物

酶反應(yīng)管

粗酶液/mL

0.1mol/LKNO3磷酸緩沖液/mL

NADH溶液/mL

0.1mol/L

pH7.5磷酸緩沖液/mL

非誘導(dǎo)－對(duì)照

1.0

1.6

0

0.2

非誘導(dǎo)－實(shí)驗(yàn)

1.0

1.6

0.2

0

誘導(dǎo)－對(duì)照

1.0

1.6

0

0.2

誘導(dǎo)－實(shí)驗(yàn)

1.0

1.6

0.2

0

第12頁(yè)/共15頁(yè)【結(jié)果計(jì)算】

樣品中酶活性（μg·g-1·h-1）=X——反應(yīng)液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮濃度（μg/mL）；V1——提取酶時(shí)加入的提取緩沖液體積（mL）；V2——酶反應(yīng)時(shí)加入的粗酶液體積（mL）；V3——與磺胺等發(fā)生顏色反應(yīng)的總體積（mL）；W——樣品質(zhì)量（g）；

t——反應(yīng)時(shí)間（h）。X*

V3

/V2*V1W*t第13頁(yè)/共15頁(yè)【注意事項(xiàng)】

硝酸還原酶容易失活，離